基于CRISPR/Cas9系统建立GPR108缺失的THP-1细胞株及其功能初步研究

目的建立稳定敲除G蛋白偶联受体108(GPR108)基因的人单核细胞白血病细胞系(THP-1),并初步研究其功能。方法根据人GPR108基因序列设计,合成可应用于成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)的单链引导RNA(sgRNA1和sgRNA2)对应的DNA,利用分子克隆技术在pL-CRISPR.EFS.GFP慢病毒载体中插入sgRNA1和sgRNA2序列,构建重组载体(pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA1和pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA2)。将测序正确的重组体与包装质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞进行病毒包装,收集病毒液并感染THP-1细胞。利用流式细胞分选技术分离GFP+细胞于96孔培养板中,培养获得单细胞克隆。利用聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测THP-1细胞中GPR108是否敲除成功。应用脂多糖(LPS)刺激GPR108-/-和GPR108+/+的THP-1细胞,Western blot法检测细胞内白细胞介素-8(IL-8)的表达,流式微球技术(CBA)检测细胞培养上清液中的IL-8浓度。结果成功构建重组慢病毒载体pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA,转染THP-1细胞后通过流式细胞仪分选获得单细胞克隆F9。PCR和Western blot法均证实F9是GPR108-/-THP-1单细胞克隆。LPS刺激GPR108-/-和GPR108+/+THP-1细胞,Western blot和CBA的结果均显示敲除GPR108的THP-1细胞中IL-8的合成和分泌明显减少。结论成功建立GPR108缺失的THP-1细胞株;缺失GPR108的THP-1细胞在受到LPS刺激时产生的趋化因子IL-8显著降低。为后续研究GPR108在免疫炎症中的作用奠定了基础。

转录因子GRHL3调控GPR108基因表达及其作用机制

目的研究转录因子果蝇头状因子(grainyhead-like,GRHL)3调控G蛋白偶联受体108(G protein-coupled receptor 108,GPR108)表达的分子机制。方法利用生物信息学分析在各种癌症组织的肿瘤细胞中,GRHL3和GPR108的表达水平以及相互关系;运用反转录定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测GRHL3和GPR108基因在人皮肤鳞癌细胞系(A-431)、人肝癌细胞系(Hep G2)以及人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)的表达;采用分子克隆技术构建含有GPR108基因启动子和突变型GPR108基因启动子的荧光素酶报告基因表达载体;通过双荧光素酶报告基因检测系统,观察GRHL3对GPR108基因启动子的调控作用;通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)分析GRHL3和GPR108启动子结合位点之间的关系。结果生物信息学分析在各种组织的肿瘤细胞中,GRHL3的表达较低,而GPR108的表达较高。利用分子克隆技术成功构建了GPR108基因启动子和突变型GPR108基因启动子荧光素酶报告基因表达载体;GRHL3对荧光素酶报告基因GPR108的启动子具有明显的抑制作用。将GPR108启动子上的结合位点删除突变后,GRHL3对GPR108基因启动子的负调控作用减弱;ChIP结果显示GRHL3能与GPR108启动子结合位点结合。结论转录因子GRHL3通过结合GPR108启动子上的保守序列5′-AACCGGTG-3′抑制GPR108表达。