伪狂犬病病毒立即早期蛋白基因缺失突变体对SV_(40)启动子的调控作用

用多次 PCR方法对伪狂犬病病毒的立即早期蛋白 ( imm ediate early protein,IE180 )基因进行部分缺失 ,测序证实缺失序列正确后 ,构建了 IE180基因部分缺失突变体的真核细胞表达载体 pc P1 P2 、pc P1 P3P2 、pc P6 P2 。将这些真核表达载体与带有 SV4 0 早期基因启动子和报告基因 CAT(氯霉素乙酰转移酶 )的 p CAT3- control载体质粒混合后 ,用质脂体介导的方法 ,共转染 Hela细胞。通过 CAT的 EL ISA方法检测瞬时表达结果表明 :突变体 P1 P2 和 P1 P3P2 对 SV4 0 启动子具有较强的激活能力 ,而 P6 P2 则对 SV4 0 启动子有较明显的抑制作用。

大豆种子成熟蛋白PM40基因表达方式分析及其启动子预测

研究大豆种子成熟蛋白PM40基因在不同逆境条件下及大豆各组织中的表达情况,并对其上游启动子序列进行生物信息学预测,为揭示PM40基因表达本质及其启动子的功能研究、利用提供理论依据。利用qRT-PCR方法,检测PM40基因在干旱、盐、低温、脱落酸条件下的表达;比较该基因在大豆根、茎、叶、花、30DAF、60DAF和90DAF中的表达;克隆PM40基因5′端上游启动子序列,并预测其含有的顺式作用元件。结果表明,PM40基因在干旱、低温和脱落酸处理不同时间下,与未处理相比,表达量均下降,在盐处理条件下,只有处理2 h时表达升高,其余处理时间基因表达下降,说明PM40基因受干旱、低温和脱落酸诱导表达下降,在盐诱导2 h时表达升高;PM40基因在大豆种子中的表达相对较高,尤其是60DAF和90DAF的种子中,相对于根的表达量为35.76,239.75倍;以大豆基因组DNA为模板,克隆PM40基因5′端上游启动子序列1 581 bp,生物信息学预测表明,PM40基因启动子序列中包含多种与种子高表达相关的顺式元件。推测大豆PM40基因启动子可能具有种子特异表达特性。

不同类型牛GPR54基因启动子变异与其表达水平的关联性

旨在研究不同类型牛GPR54基因启动子的变异对其表达水平的影响,以揭示牛GPR54基因多态性与牛早熟性之间的关联性。提取荷斯坦牛、皖东黄牛及江淮水牛3种牛血液白细胞总RNA,通过PCR、测序、RT-PCR和双荧光素酶报告基因的方法,检测不同牛GPR54基因启动子区的多态性,启动子效率以及GPR54基因的表达水平,分析启动子变异在牛品种、年龄和性别间对GPR54基因表达的效应。结果表明,GPR54基因启动子存在多个SNP位点,3种牛的启动子型存在明显的差异,其中荷斯坦牛GPR54基因启动子效率是江淮水牛的4.44倍,是皖东黄牛的1.99倍,而皖东黄牛启动子效率是江淮水牛的2.24倍。RT-PCR显示,青年牛GPR54基因表达水平高于成年牛;荷斯坦牛高于皖东黄牛和水牛,水牛的GPR54表达水平最低;母牛的GPR54基因表达水平极显著高于公牛(P<0.01)。综上表明,不同牛的早熟性与GPR54启动子存在密切的关联性。

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应 (PCR)扩增HBVX基因 ,克隆至真核表达载体 pVR10 12中 ,构建HBVX基因重组表达载体 pVR10 12 X ;以该质粒转染HepG2细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞X蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pSV lacZ共转染HepG2细胞 ,用试剂盒法检测 β 半乳糖苷酶表达活性。结果质粒 pVR10 12 X在HepG2细胞瞬时表达X蛋白 ,共转染实验中 pVR10 12 X组 β 半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的 3 2倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 。

汉族人IL-12b和IL-10启动子区基因多态性与HBV感染的相关性

目的:我国是一个乙型肝炎大国,乙型肝炎感染及其转归显然有人种、人群差异。本研究对我国汉族人群中乙型肝炎病毒(hepatitis virus B,HBV)感染和发病与白介素-12p40(interleukin-12p40,IL-12b)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)启动子区基因多态性之间的关系进行了探讨。方法:利用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析(restricted enzyme-fragment length polymorphisms,PCR-RFLP)的方法对非相关人群的健康人群与HBV感染患者(轻、中度慢性肝炎、重度慢性肝炎)和HBV感染家系中的HBV携带者、既往HBV感染者、健康人群的IL-12b,IL-10启动子区-540C、-592A(IL10-5’A,IL12-5’C)单碱基多态性(SNP)进行了分析,并且对两个突变位点进行了基因测序。使用SAS统计软件进行统计分析。结果:IL10-5’A、IL12-5’C在非相关人群中的分布符合Hardy-Weinberg平衡。非相关人群IL10-5’A、IL12-5’C突变等位基因在HBV患者中的频率近似于健康人群(IL10-5’A,HBV患者42.08％,健康人41.9％,P>0.05;IL12-5’C,HBV患者55.8％,健康人64.6％,P>0.05)。IL10-5’A与IL12-5’C基因分布在慢性肝炎(轻中)和慢性肝炎(重)两组无显著性差异(P>0.05)。提示IL10-5’A,IL12-5’C单碱基多态性(SNP)对乙型肝炎病情轻中无影响;HBV感染家系中IL10-5’A,IL12-5’C单碱基多态性在携带者、健康人群以及既往感染者三组间均匀分布,IL12-5’C突变频率与非相关人群相似(非相关人群-540T 55.3％,相关人群-540T 55.9％);IL10-5’A 突变频率与非相关人群有显著性差异(非相关人群-592C42.0％,相关人群-592C 19.5％,P<0.01)。结论:IL10-5’A突变比IL12-5’C突变在HBV感染家系中可能起到更重要的作用,或影响相关人群对HBV的易感性。

SV40启动子在烟草体内的驱动特性研究

根据SV40启动子序列设计引物,PCR扩增该启动子后,成功构建了具有SV40启动子和GUS报告基因的植物表达载体pLpPSG,并将重组质粒转化到烟草叶片中.通过SV40启动子驱动的GUS基因在烟草叶片内的瞬时性表达,研究了该启动子在植物基因表达中的驱动特性.结果表明:SV40启动子可启动GUS基因在烟草体内的表达,其提高基因表达水平达到2×35S启动子的(88.5±19.2)%.

放线菌酮诱导SV40增强子的启动子活性的研究

在蛋白质合成抑制剂放线菌酮（ＣＨＸ）诱导下，ｐＣＡＴ－Ｅ质粒中ＳＶ４０增强子能启动ＣＡＴ基因的表 达．在很短的时间（５ｍｉｎ）和很低的 ＣＨＸ质量浓度（３０ｎｇ／ｍＬ）条件下，ＣＨＸ即能诱导ｐＣＡＴ－Ｅ中 ＳＶ４０增 强子的启动子活性．为了研究ＣＨＸ诱导的ｐＣＡＴ－Ｅ质粒中ＳＶ４０增强子的启动子活性是否与位置有关，构建 了两个重组体：ｐＣＡＴ－Ｂａｓ－Ｅｎｈ（－）和ｐＣＡＴ－Ｂａｓ－Ｅｎｈ（＋），改变了ＳＶ４０增强子序列与载体中ＣＡＴ报告基因的相 对位置，用重组质粒转染ＣＨＯ细胞并用ＣＨＸ处理，检测不到ＣＡＴ活性，说明ｐＣＡＴ－Ｅ质粒中ＣＨＸ所诱导的 ＳＶ４０增强子的启动子活性受ＳＶ４０增强子位置的影响．

猪GPR40基因的生物信息学分析

克隆猪GPR40(G protein-coupled receptor)基因,并对其生物信息学进行分析。结果表明,克隆的该基因(GenBank登陆号为EU366318)与已发表的人、大鼠和小鼠GPR40基因核苷酸序列同源性分别为85%、80%和82%,氨基酸序列同源性依次为86%、82%和83%,其编码的蛋白质分子量为22.59 ku,等电点(pI)9.54,包含215个氨基酸残基,有许多内切酶位点;结构分析发现,该基因无信号肽,但包含一个7次跨膜结构,其蛋白产物多集中在细胞膜上。表明该蛋白结合在细胞膜上作为许多信号分子受体,参与体内脂类代谢等。

SV40早期启动子中原核增强子样序列的初步研究

萤火虫荧光素酶基因 c DNA真核表达载体 p GL2 可在原核细胞中高效表达 .该载体中含有 SV4 0早期启动子及荧光素酶基因 c DNA 5’端总长共 75 8bp的 DNA碱基序列 ,经计算机分析发现 ,在 SV4 0早期启动子中含有 SV4 0基因组 Hind B片断中一段长为 4 9bp的 DNA序列 ,且荧光素酶基因 c DNA编码区的 5’端含有一个原核细胞基因表达调控区相似序列 .将 p GL2 中的荧光素酶基因 c DNA(L uc)克隆入真核表达载体 p ED中 ,构建成 p ED- Luc.该载体经表达测定后 ,只在真核细胞中表达 ,在原核细胞中不表达 .这说明荧光素酶基因 c DNA编码区的 5’端的原核细胞基因表达调控区相似序列不具表达有活性的荧光素酶的功能 .经 DNA序列对比研究 ,认为 p GL2 含有的 SV4 0基因组 Hind B片段 5 12 3bp～ 5 171bp长 4 9bp的 DNA序列可能就是 Hind B片段的原核增强子功能的决定序列 .

染色质免疫沉淀分析胰岛β细胞中TCF7L2与GPR40的结合

目的探讨转录因子TCF7L2与GPR40基因启动子的相互作用。方法采用染色质免疫沉淀(CHIP)技术,在胰岛βTC6细胞株中,用TCF7L2特异性抗体沉淀DNA,聚合酶联式反应(PCR)检测GPR40基因5′特异性序列。结果在TCF7L2特异性抗体免疫沉淀的DNA片段中,扩增出GPR40基因5′特异性序列。结论在胰岛βTC6细胞中,转录因子TCF7L2与GPR40基因启动子存在特异的结合区域,TCF7L2可能参与GPR40的表达调控。

山杏种子PsMATE40基因启动子的克隆及驱动表达分析

【目的】转运蛋白PsMATE40在山杏种子苦杏仁苷转运中起到重要作用。克隆PsMATE40基因特异启动子并分析其驱动基因表达活性,为PsMATE40基因及其启动子的应用奠定基础。【方法】依据前期克隆得到的PsMATE40基因,以山杏种子基因组DNA为模板,通过染色体步移克隆得到PsMATE40基因特异启动子全长序列(命名为ProPsMATE40),预测分析其顺式调控元件,采用GUS组织化学染色分析检测启动子活性;利用无缝克隆方法分别构建组成型启动子CaMV35S和特异启动子ProPsMATE40驱动的PsMATE40基因的植物表达载体,开展农杆菌介导的烟草瞬时转化,利用RT-qPCR技术比较分析它们驱动PsMATE40基因的转录表达。【结果】山杏种子PsMATE40基因启动子全长序列为1964 bp,含有2种启动子核心元件(CAAT-box和TATA-box)、多种激素信号(生长素、茉莉酸和水杨酸等)响应元件和胁迫(光、干旱和损伤等)响应元件以及种子发育调控元件等,自身特异启动子ProPsMATE40驱动的PsMATE40基因表达水平明显高于CaMV35S。【结论】山杏种子PsMATE4基因表达可能受植物激素以及生物与非生物胁迫等多种因素的复杂调控,而自身启动子可有效促进PsMATE40基因的转录表达。

转基因重组质粒ATP4B-SV40T-IRES-GFP的构建及鉴定

目的:构建ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒并进行鉴定.方法:根据小鼠ATP4B启动子序列设计引物,获得的小鼠ATP4B基因启动子序列,并加入限制性内切酶酶切位点.将其装入载体IRES-GFP,获得重组载体ATP4B-IRES-GFP并进行酶切鉴定.之后将SV40T基因克隆入ATP4B-IRES-GFP载体,并用限制性内切酶PstI和AseⅠ进行验证.结果:将小鼠ATP4B启动子序列插入IRES-GFP载体,经过酶切验证获得正确的ATP4B-IRES-GFP质粒;将SV40T片段插入ATP4B-IRES-GFP,质粒测序及酶切结果验证获得正确的ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒.显微注射入小鼠受精卵可获得阳性小鼠.结论:成功构建ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒,可用于下一步构建原发性胃癌转基因小鼠.

牛GPR54基因C-816T/T-754C品种间分布及其与早熟性的关联

GPR54基因是牛早熟性状的重要候选基因。以42头本地黄牛、44头西门塔尔牛及其116头杂交育种群等为试验群体,分析牛GPR54基因5’调控区C-816T/T-754C在不同牛群体中的分布、启动子效率及其与牛早熟性状的关联性。提取牛耳组织或血液基因组后,通过PCR产物测序鉴别SNP位点,双荧光素酶报告基因验证其SNP位点对启动子效率的影响。结果表明,在GPR54基因CDS上游5’调控区检测到T-754C和C-816T 2个SNP位点;西门塔尔牛和安徽地方黄牛分别只有1种基因型,即CCTT和TTCC,单倍型存在连锁不平衡。报告基因验证2种单倍型的启动子有明显差异,其中-816CT-754启动子的效率要比-816TC-754提高34.31%(P<0.01)。关联分析显示,816CC754TT基因型牛的初情期比816TT754CC基因型牛的初情期提前了1.28月。

纤维连结蛋白启动子的克隆及转录活性的研究

目的:克隆纤维连结蛋白(FN)启动子和检测其转录活性,并初步研究增加SV40增强子对其转录活性的影响。方法:从正常人gDNA中克隆FN启动子,驱动氯霉素乙酰转移酶报告基因表达,构建成有SV40增强子和无SV40增强子两个重组体报告载体。利用脂质体介导的转染技术导入HT1080细胞,检测各重组体的瞬时表达,确定克隆FN启动子转录活性和SV40增强子对其转录活性的影响。结果:克隆的FN启动子在HT1080细胞中活性比SV40启动子稍强,在加入SV40增强子时活性提高了约6倍。结论:成功的克隆FN启动子,在HT1080细胞中有活性,通过增加SV40增强子能大大提高其活性,为运用FN启动子和特异性靶细胞治疗各种遗传性疾病提供了一定基础。

SV40TAg转基因小鼠模型的建立及其表达

为了建立中枢神经系统肿瘤小鼠模型,构建了大鼠神经元特异性烯醇化酶(ratneu-ron-specificenolase,NSE)基因启动子调控下的猿猴病毒40大T抗原基因(simianvirus40largeTantigengene,SV40TAg)转基因载体,通过受精卵雄原核显微注射的方法制备转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型;RT-PCR和Northern印迹检测转基因阳性鼠中SV40TAgRNA水平的表达及其组织特异性;免疫组化检测其蛋白质水平的表达。经显微注射共获得9只首代转基因阳性鼠(首建者,Founder小鼠),其中2例出生时即发生神经干细胞来源的肿瘤,其他Founder小鼠经繁育后共建立了5个SV40TAg转基因小鼠系,其中有4个系检测到SV40TAgRNA水平的表达且特异性地表达于脑组织,但未检测到蛋白质水平的表达。研究表明NSE启动子活性具有较强的组织特异性,并起始于小鼠胚胎发育期;SV40TAg具有明显的致癌作用,且SV40TAg诱发的神经系统肿瘤易造成转基因小鼠早期死亡。

β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在大型经济海藻裙带菜中的瞬间表达

用高压氦气式基因枪将SV4 0启动子驱动下的 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)导入大型经济海藻裙带菜不同部位的组织切块中 ,4 8小时后染色检测 ,在假根、孢子叶和叶片中均检测到了lacZ的瞬间表达。研究还发现 ,对于裙带菜组织块的基因枪法转化 ,压强130 0psi优于 110 0psi。另外在裙带菜中没有发现半乳糖苷酶的染色本底。本文结果提示 :基因枪法是有效的裙带菜遗传转化方法 ;lacZ可以作为裙带菜基因工程研究的报告基因 ,SV4 0启动子能有效驱动外源基因在裙带菜中表达 ,没有组织特异性。这是lacZ在裙带菜中表达的首次报道 。

基因枪法建立紫菜丝状体遗传转化模式

以坛紫菜和条斑紫菜的自由丝状体为材料,利用基因枪法分别转化CaMV35S、SV40、FCP、Amt、Ubi 5种启动子与报告基因组合,转化后48h进行原位组织化学染色检测,首次针对重要经济红藻紫菜的自由丝状体建立并优化遗传转化技术,为紫菜研究提供了新工具。结果显示,SV40启动子可以驱动laeZ报告基因(编码β-半乳糖苷酶)在紫菜丝状体中的瞬间表达,空白与阴性对照未检测到本底;其它4种启动子未检测到基因表达。进一步优化实验发现,在可裂膜650psi、轰击距离6cm下获得最高转化效率为8.0×10^(-5),经定量检测与双因子方差分析,是最佳转化参数,提示基因枪参数对外源基因转化效率具显著影响。

哺乳动物病毒SV40早期启动子在鱼类细胞中具转录调节功能

目前由于缺乏鱼类本身的同源启动子,因此对鱼类进行外源基因转移的研究,一般都借用哺乳动物细胞的启动子或动物病毒启动子.对于这些启动子的可用性,尚未见有直接的证据。