复发/难治性多发性骨髓瘤免疫治疗新策略:GPRC5D双特异性抗体

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种骨髓中产生单克隆免疫球蛋白的克隆性浆细胞出现恶性增殖的血液系统疾病,目前常规治疗方案包括蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物、单克隆抗体和造血干细胞移植等。尽管反应深度有所改善,生存期延长,但由于复发和耐药克隆的出现,复发/难治性多发性骨髓瘤(relapsed/refractory multiple myeloma,RRMM)仍是一种无法治愈的疾病。因此,迫切需要新的治疗方法来克服对现有药物不可避免的耐药性,特别是针对新靶点或具有新的作用机制的治疗方法。近年来,RRMM新的治疗方法主要集中在免疫疗法上,包括抗体-药物偶联物、双特异性抗体和嵌合抗原受体T细胞等,本文旨在对免疫治疗靶点GPRC5D靶向的双特异性抗体在RRMM中的应用进展进行综述。

lncRNA GPRC5D-AS1对地塞米松诱导小鼠成肌细胞肌萎缩的抵抗和再生作用及其机制

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)GPRC5D-AS1对地塞米松诱导的小鼠成肌细胞肌萎缩的抵抗和再生作用,并阐明其作用机制。方法:选取对数生长期C2C12细胞,检测0、25、50、75、100、200和400 mg·L^(-1)地塞米松诱导24、48和72 h后C2C12细胞存活率,筛选肌萎缩模型诱导的最佳作用剂量和时间。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测C2C12细胞中lncRNA GPRC5D-AS1表达水平以验证细胞模型。将C2C12细胞分为正常组、模型组、lncRNA GRPC5DAS1-NC组和lncRNA GRPC5D-AS1-OE组,RT-qPCR法检测各组细胞中lncRNA GPRC5D-AS1表达水平,流式细胞术检测各组细胞中活性氧(ROS)水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组细胞中谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)、铁离子(Fe2+)和丙二醛(MDA)水平,透射电镜观察各组细胞线粒体超微结构表现,免疫荧光法检测各组细胞中成肌分化蛋白(MyoD)表达情况,Western blotting法检测各组细胞中铁死亡相关蛋白表达水平。结果:100 mg·L^(-1)地塞米松诱导48 h时造模效果最佳。与正常C2C12细胞比较,100 mg·L^(-1)地塞米松诱导48 h后C2C12细胞中lncRNA GPRC5DAS1表达水平降低(P<0.05),证实lncRNA GPRC5D-AS1在肌萎缩模型中有调控作用。RT-qPCR法检测,与正常组比较,模型组细胞中lncRNA GRPC5D-AS1表达水平降低(P<0.05);与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较,lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中lncRNA GRPC5D-AS1表达水平升高(P<0.05)。流式细胞术检测,与正常组比较,模型组细胞中ROS水平升高(P<0.05);与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较,lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中ROS水平降低(P<0.05)。ELISA法检测,与正常组比较,模型组细胞中Fe2+和MDA水平升高(P<0.05),GPX4水平降低(P<0.05);与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较,lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中Fe2+和MDA水平降低(P<0.05),GPX4水平升高(P<0.05)。透射电镜观察,正常组细胞外形圆整,大小正常,膜上绒毛丰富,线粒体细胞器形态正常;模型组细胞中线粒体数量减少,胞浆颗粒化,线粒体结构模糊肿胀并出现典型铁死亡相关现象;lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中线粒体数增加,胞浆颗粒化现象减少,线粒体结构较清晰。免疫荧光法检测,与正常组比较,模型组细胞中MyoD表达减少,细胞发生肌萎缩;与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较,lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中MyoD表达明显增加,细胞肌萎缩现象缓解,成肌细胞再生较多。Western blotting法检测,与正常组比较,模型组细胞中长链脂酰辅酶A合成酶(ACSL)4蛋白表达水平升高(P<0.05),溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和GPX4蛋白表达水平降低(P<0.05);与模型组和lncRNA GRPC5D-AS1-NC组比较,lncRNA GRPC5D-AS1-OE组细胞中ACSL4蛋白表达水平降低(P<0.05),SLC7A11和GPX4蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:lncRNA GPRC5DAS1地塞米松诱导的成肌细胞铁死亡起到保护作用,可促进细胞修复再生,其作用机制与调控SLC7A11/GPX4/ACSL4信号通路有关。

GPRC5D CAR-T细胞治疗复发/难治性多发性骨髓瘤:单臂Ⅱ期临床试验

G蛋白偶联受体,C类5组成员D(G-protein-coupled receptor family C group 5 member D,GPRC5D)被认为是多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)免疫治疗的潜在靶标。2021年9月1日—2022年3月23日,本Ⅱ期单臂临床试验共纳入33例复发/难治(relapsed or refractory,R/R)MM患者(18~70岁),在接受淋巴细胞清除化疗后输注2×106/kg抗GPRC5D嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞,随后进行有效性和安全性的评估。在中位随访5.2(3.2~8.9)个月时,患者总体反应率为91%(95%CI 76%~98%,30/33例),包括11例(33%)严格意义上的完全缓解,10例(30%)完全缓解,4例(12%)非常好的部分缓解和5例(15%)部分缓解。9例既往接受过抗B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA)CAR-T细胞治疗的患者疗效均达部分缓解或以上,其中包括2例接受过2次或以上抗BCMA CAR-T细胞输注的患者。3级或更高的血液学毒性为中性粒细胞减少[33例(100%)]、贫血[17例(52%)]和血小板减少症[15例(45%)]。33例患者中25例(76%)发生细胞因子释放综合征(均为1级或2级),3例患者发生神经毒性(1例2级和1例3级免疫效应细胞相关神经毒性综合征,1例3级头痛)。综上所述,抗GPRC5D CAR-T细胞疗法在R/R MM患者中表现出令人鼓舞的临床疗效和可控的安全性。对于抗BCMA CAR-T细胞治疗后进展或无效的MM患者,抗GPRC5D CAR-T细胞治疗可能是一种潜在的替代选择。

基于报告基因的抗CD3×GPRC5D双特异性抗体生物学活性测定方法建立

目的:建立抗CD3×GPRC5D双特异性抗体(bispecific antibody, BsAb)生物学活性的报告基因测定方法。方法:构建Jurkat/NFAT-Luc转基因细胞株作为效应细胞,MM.1R细胞系作为靶细胞,建立和优化抗CD3×GPRC5D双特异性抗体生物学活性检测方法并进行方法学验证。分别用优化后的报告基因法和PBMC杀伤试验评价不同类型的抗CD3×GPRC5D双特异性抗体生物学活性。结果:报告基因法优化后确定靶细胞为MM.1R细胞,细胞铺板密度为2×10^(4)个·孔^(-1),效靶比1∶1,抗体起始浓度为20μg·mL^(-1),2倍稀释1次后,再6倍梯度稀释,共10个浓度点,诱导时间6 h。方法验证结果说明该方法具有良好的专属性,制备50%,75%,100%,150%和200%理论效价样品,进行准确性、精密度和线性验证,结果显示生物学活性回收率在97.85%~106.51%,变异系数均<10%;相对效价理论值与实测值直线回归分析相关系数为0.997 8。同时,该方法适用于各类抗CD3×GPRC5D双特异性抗体,均有较好的剂量反应曲线,且与PBMC杀伤试验结果具有较好的一致性。结论:本研究成功建立抗CD3×GPRC5D双特异性抗体生物学活性的报告基因检测方法,该方法具有较高的准确性和精密度,且特异性良好,可作为此类双特异性抗体活性评价的常规方法。