绿豆GPX基因家族鉴定及其对非生物胁迫的响应

[目的]本文利用生物信息学方法从绿豆基因组中筛选谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)基因家族成员,并探究其组织表达模式及其对若干胁迫的响应。[方法]利用生物信息学的方法对绿豆GPX家族的等电点、相对分子质量、共线性、上游顺式作用元件等进行分析,通过转录组测序和RT-qPCR进一步分析绿豆GPX基因家族的组织表达模式以及在不同逆境胁迫和激素作用下的表达水平。[结果]从绿豆基因组中筛选出8个GPX基因,其不均匀分布于1/2/3/5/10号染色体上。基因结构及基序分析结果显示,8个GPX的基因结构类似,均含有6个内含子区域,并且大部分GPX成员都具有UTR区。转录组以及RT-qPCR分析结果表明,多个GPX家族成员均能响应多种逆境胁迫。组织表达分析结果显示,不同GPX家族成员在不同组织中呈特异性表达;GPX家族整体在绿豆中表达丰度较低,但表达量能被各种胁迫强烈诱导。[结论]绿豆GPX基因家族响应多种非生物胁迫,不同GPX成员响应的胁迫类型不同。

三角帆蚌GPX基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

根据本实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列,利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)基因cDNA全序列。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1286bp,包括5′端非翻译区(Untranslated Region)39bp、3′端非翻译区659bp和开放阅读框(Open reading frame,ORF)588bp,共编码195个氨基酸,分子量约为22.2kDa,理论等电点为8.44,属于含硒类GPX。该氨基酸序列具有GPX所有亚型中均高度保守的3个环状结构,对酶的三级结构起稳定作用。在线分析结果表明:GPX的氨基酸序列不存在明显的疏水区,也不存在信号肽序列。氨基酸相似性对比结果显示,三角帆蚌GPX氨基酸序列与脊椎动物GPX-2及GPX-1的序列相似度较高,为73.1%-80.8%,与其他型GPX相似度较小,相似度低于60%。构建的系统进化树显示三角帆蚌GPX与其他几种鱼类GPX聚为一类,与其他已发表的几种软体动物GPX相距较远,推测本实验克隆的三角帆蚌GPX基因和已发表的软体动物不属于同一种GPX类型。

三角帆蚌GPX基因结构特征及抗性相关SNP的筛选

根据三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)基因cDNA序列,通过PCR和基因组步移法,从三角帆蚌基因组DNA中扩增出GPX基因全长及其5′调控区。序列分析表明,该基因序列全长6 708 bp,含有2个外显子,1个内含子。5′调控区为992 bp,含有启动子的核心序列TATA盒以及其他一些转录调控元件,如AP1、C/EBP、CdxA。2个外显子长度分别为273 bp和991 bp,内含子长度为4 491 bp。通过直接测序法在三角帆蚌抗性群体和易感群体中筛选GPX基因的SNPs,并研究这些多态性位点与抗逆性状的相关性。共获得了16个SNP位点,其中启动子区的A-99G位点、A-86C位点、A-49C位点,内含子区的A2841T位点、C2847T位点、G3146C位点、A3150G位点以及G4645T位点共8个SNP位点的基因型频率和等位基因频率在抗性和易感群体中均存在显著性差异(P<0.05)。连锁不平衡分析结果显示GPX基因A-86C位点、A-49C位点、C2847T位点、A3150G位点与G4645T位点之间,以及A2841T位点与G3146C位点之间均存在强连锁不平衡。同时单倍型分析发现,在抗性群体中单倍型分别为ACTGT和TG的个体出现的频率显著高于易感群体中出现的频率。这些结果表明,GPX基因的部分SNPs可作为三角帆蚌抗病辅助育种的候选分子标记。

茶树CsGPX基因克隆及干旱胁迫下的表达分析

采用反转录-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,简称RT-PCR)技术,从茶树叶片中克隆长387 bp的Cs GPX基因片段,生物信息学分析结果表明该基因片段编码的氨基酸序列为GPX蛋白的保守序列,系统进化树分析结果揭示该蛋白与拟南芥At GPX6、杨树Pt GXP6等亲缘关系较近。定量PCR分析结果表明,干旱胁迫处理12 h内,GPX表达量明显上升,初步分析茶树Cs GPX基因在干旱胁迫反应中发挥重要作用。

莆田豆梨GPX基因克隆与生物信息学分析

采用同源克隆RT-PCR结合RACE技术,从福建省地方梨种质资源莆田豆梨中克隆出GPX基因的cDNA全长序列分离克隆并运用生物信息学方法对序列进行分析。克隆得到福建省地方种质资源莆田豆梨GPX基因932bp的cDNA全长序列,分析表明,该序列的5′端和3′端的非编码序列长度分别为204bp和221bp,开放阅读框为507bp,编码168个氨基酸。氨基酸序列与苹果、柑橘、龙眼、荔枝的同源性90%以上。GPX基因在GenBank上登录,登录号为JQ011278。生物信息学分析表明:GPX蛋白的分子量是20 083.0Da,理论等电点pI 5.61,是不具跨膜结构域的亲水性胞质蛋白,不具有信号肽,细胞主要定位在细胞质上,有1个区域最有可能形成卷曲螺旋,由26.58%的a螺旋,19.26%的延伸链和54.16%的不规则卷曲组成,磷酸化位点有12个。此外,还对GPX酶分子三维立体结构等进行预测和分析。

石榴PgGPX基因克隆及盐胁迫下的表达分析

该研究以‘红玉石籽’籽粒为材料,通过RACE技术克隆了石榴GPX基因,利用Real-time PCR检测石榴在不同器官中及石榴叶片在盐胁迫处理下的相对表达量。结果表明:(1)PgGPX基因cDNA全长872bp,其中开放阅读框504bp,编码168个氨基酸。生物信息学分析显示,该蛋白具有植物GPX的典型结构,与可可树、荔枝、甜橙、玉米等植物的GPX基因相比,具有较高的一致性,分别为90.30%、87.40%、86.80%、86.20%。(2)PgGPX在石榴的叶片、花瓣和籽粒中均有所表达,且具有组织特异性,在盐胁迫下,石榴叶片中的PgGPX表达量显著上升。推测PgGPX基因在胁迫反应中可能发挥重要作用。

哺乳动物Gpx基因家族进化选择和功能分歧研究

研究哺乳动物谷胱甘肽过氧化物酶基因家族(Gpx)的亲缘关系和进化选择压力性质。从NCBI等网站获取哺乳动物Gpx基因编码区核酸序列和GPX蛋白氨基酸序列,并用MEGA、Clustal构建亲缘关系树,用SignalP和TargetP分析信号肽和亚细胞定位信息;用K estimator和PAML分析其Gpx基因家族进化先后顺序和选择压力;用Diverge分析GPX蛋白家族功能分歧。结果表明,GPX蛋白家族进化中形成两个亚类,其一包括GPX1和GPX2,其二包括GPX3、GPX5和GPX6;各GPX蛋白成员均有高度保守的GPX蛋白家族基序和高度保守的硒代半胱氨酸或半胱氨酸残基,氨基端信号肽分析显示,GPX1蛋白为胞浆线粒体型,其余家族成员均为胞外分泌型;哺乳动物Gpx1基因进化上受到严格的负选择作用,Gpx基因家族成员保守区也受到负选择作用,但用枝位点模型却检出了正选择作用,GPX蛋白家族内存在轻微的功能分歧。哺乳动物GPX蛋白家族的进化上的负选择作用表明其在哺乳动物清除自由基抗氧化方面的关键作用。

白菜谷胱甘肽过氧化物酶基因GPX的鉴定与分析

为研究白菜谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)基因的生物学特征,从白菜全基因组数据库中筛选了10个GPX基因。基于公开的白菜转录组测序数据,分析了GPX基因在胚胎发育和器官中的表达情况,并且通过生物信息学手段对这10个GPX基因进行基因定位、启动子分析、基因结构、系统树构建和基因表达等研究。结果表明,Br GPX5基因的编码区中有6个内含子,其余基因均只有5个内含子,说明Br GPX5基因在进化过程中获得了一个内含子,导致氨基酸分子量增加;另外,每个GPX基因的启动子区都有2个及以上的E-box元件。

猪GPX5基因、FUT1基因和NCOA1基因的多态性分析

采用PCR-RFLP法对大白猪、杜洛克、长白猪、民猪和野家杂交猪的谷胱甘肽过氧化物酶5(Glutathion-Peroxi-dase 5,GPX5)基因、岩藻糖转移酶1(Fucosyltransferase1,FUT1)基因和核受体辅激活蛋白1(Nuclear receptor co-activator 1,NCOA1)基因进行多态性检测,结果表明:GPX5基因用HinfⅠ酶切可获得3种基因型,FUT1基因用HhaⅠ酶切可获得3种基因型,NCOA1基因用RsaⅠ酶切可获得3种基因型。同时对不同基因的基因型频率和基因频率进行计算,并分析相应基因的遗传效应。

Gpx基因多态性与克山病患者血硒、Gpx-1酶活性的关系

目的探究Gpx基因多态性与克山病患者血硒、Gpx-1酶活性的关系。方法 30例克山病患者,作为观察组;并将同期体检的30例健康人作为对照组。对两组的血硒、Gpx-1酶活性以及Gpx基因多态性进行检测,探究其相关性。结果经检测,血硒范围为0.02~0.13μg/ml,Gpx-1酶活性在47.9~172.5U/g·Hh,且Gpx-1酶活性与血硒呈现出明显的正相关关系(P<0.05),Gpx基因多态性与血硒以及结Gpx-1酶活性有一定的关联性,血硒水平与Gpx基因多态性两者有剂量依赖负相关关系。结论 Gpx-1酶活性的降低很大程度上与低硒、Gpx基因多态性有关,Gpx基因多态性、低硒两者相互作用,能够增加克山病患者的发病风险。

食管鳞癌中GPX3基因的甲基化特征及其临床意义

目的:采用将食管鳞癌组织和癌旁组织相对比,并将食管鳞癌患者的血浆与正常人的血浆相对比的策略,检测GPX3的甲基化状态和频率。结合患者的临床病理特征,分析GPX3基因甲基化在食管鳞癌中的意义。方法:收集42例食管鳞癌组织标本和相对应的癌旁组织标本,同时收集42例食管鳞癌患者和50例正常人的血浆标本;应用甲基化特异性PCR(MSP)结合琼脂糖凝胶电泳检测GPX3在组织和血浆中的甲基化情况,对比分析。结果:GPX3在肿瘤组织中的甲基化频率为54.8%,显著高于癌旁组织9.5%(P<0.001)。GPX3在肿瘤患者血浆中的甲基化频率为40.5%,在正常对照组的血浆中没有检测到甲基化。组织中的甲基化频率在病理分期为T3组和N2组分别显著高于病理分期为T1-T2组和N0-N1组。血浆中的甲基化频率在病理分期T3组明显高于病理分期T1-T2组。结论:GPX3在食管鳞癌组织的甲基化频率高于癌旁组织,在食管鳞癌患者血浆中的甲基化频率显著高于正常人,且临床分期越晚的甲基化频率越高。

莱芜猪GPx4基因在不同组织中的表达规律研究

为研究GPx4基因mRNA在莱芜猪不同组织中的差异表达规律,探讨该基因与地方猪种抗氧化性能的关系。本研究以5头莱芜猪为实验材料,提取10种组织的总RNA,应用实时荧光定量PCR技术,检测GPx4基因在莱芜猪不同组织的mRNA相对表达量。实时荧光定量PCR研究结果显示:GPx4基因在莱芜猪各组织中均有表达,组织之间的相对表达量存在显著差异(P<0.05);GPx4基因在莱芜猪脑、心、肝、脾等组织高丰度表达,并且极显著地高于其他组织中的表达量(P<0.01)。GPx4基因在不同组织中的表达水平由高到低依次为:肌肉>脊髓、大肠、背膘、小肠>肺,差异显著(P<0.05)。

基于数据库探索GPX4基因在泛癌中的潜在价值

目的探索介导肿瘤铁死亡过程中的关键基因GPX4在泛癌中的潜在价值。方法采用UALCAN和TIMER数据库分析GPX4基因的mRNA表达水平;cBioPortal分析GPX4在泛癌中的基因变异情况;GEPIA分析GPX4表达与患者生存之间的关系;LinkedOmics分析靶向调控GPX4基因表达的MIR种类及KEGG通路分析;TIMER和GEPIA数据库研究GPX4基因与免疫细胞浸润的相关性及与免疫细胞标记基因的相关性。结果GPX4基因在15种肿瘤组织中异常表达,12种癌组织中存在变异,其表达与结肠癌(COAD)、胃癌(STAD)及甲状腺癌(THCA)患者生存期相关,MIR-503及MIR-127共同正向调节COAD、STAD及THCA中GPX4的表达,14种MIR共同负向调节GPX4表达。在COAD、STAD及THCA中,GPX4参与氧化磷酸化、磷脂酰肌醇信号系统、赖氨酸退化、谷胱甘肽代谢、JAK-STAT信号通路及MicroRNAs调节等过程。在THCA中,GPX4与B细胞、CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞及巨噬细胞浸润水平有相关性。结论GPX4基因的表达、突变及调节与COAD、STAD及THCA的发生发展、患者的预后、肿瘤免疫有一定的相关性,为进一步研究其在泛癌中的作用奠定了基础。

小鼠林蛙油灌胃后其肝组织中Gpx4基因的表达规律研究

为了验证林蛙油抗氧化、抗衰老的作用,试验以小鼠为动物模型,通过直接灌胃的方法,同时利用Real-time PCR的方法分析小鼠肝脏组织中抗氧化相关基因Gpx4的时空表达规律。结果表明:林蛙油能使小鼠肝组织中抗氧化基因Gpx4表达量明显增加,并且对老年鼠的影响大于青年鼠。说明林蛙油对老年鼠的抗氧化、抗衰老作用明显。

黔北麻羊GPx3基因克隆、生物信息学分析及在不同性腺组织中的表达分析

为探究GPx3基因在产单、多羔黔北麻羊不同性腺组织中的表达规律及其蛋白质的结构与功能,本实验以黔北麻羊为研究对象,采集单、多羔黔北麻羊的下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢提取总RNA,运用qRT-PCR技术,分析GPx3基因mRNA在单、多羔黔北麻羊5个不同性腺组织中的表达水平;PCR法扩增克隆黔北麻羊GPx3基因的CDS区;生物信息学分析并预测黔北麻羊GPx3蛋白的结构与功能。qRT-PCR结果显示:GPx3基因在单、多羔黔北麻羊的5个不同性腺组织中均有表达,且均在卵巢的表达量最高;除下丘脑外,其余各组织在多羔组中的表达量均极限著高于单羔组。T克隆结果表明:黔北麻羊GPx3基因CDS区序列为681 bp,与NCBI上收录的山羊的mRNA序列同源性达99.85%。生物信息学分析发现:黔北麻羊GPx3蛋白可能位于细胞外,且具有信号肽,属于不稳定的亲水性分泌蛋白,其三级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成;遗传进化树分析得出,黔北麻羊GPx3基因与绵羊的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。本研究对GPx3基因进行了克隆和生物信息学分析,并揭示了GPx3基因在黔北麻羊不同性腺组织中的表达差异性,为进一步探究GPx3基因对黔北麻羊繁殖性状的调控机制提供基础。

林蛙油灌胃小鼠后其脾脏组织中Gpx4基因的表达规律研究

为了验证林蛙油抗氧化、抗衰老的作用,试验以小鼠为动物模型,利用Real-time PCR方法分析小鼠脾脏组织中抗氧化相关基因Gpx4的时空表达规律。结果表明:林蛙油能使小鼠脾脏组织中抗氧化基因Gpx4表达量明显增加,并且对老年鼠的影响大于青年鼠。说明林蛙油对老年鼠的抗氧化、抗衰老作用明显。

非小细胞肺癌组织中GPX3基因的表达及其临床意义

目的:探讨非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织中GPX3(谷胱甘肽过氧化物酶3)基因mRNA和蛋白表达及其临床意义。方法:对60例非小细胞肺癌患者,及癌旁组织采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和Western-blot技术检测GPX3在其肺癌组织及癌旁组织中的表达,分析其与患者临床病理特征的关系。结果:RT-PCR结果显示GPX3 mRNA在癌旁组织中的表达量高于非小细胞肺癌组织,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),并且其表达水平与肿瘤病理分期、分化程度和淋巴结转移明显相关(P<0.05)。Westernblot结果显示GPX3蛋白在癌旁组织中表达明显高于非小细胞肺癌组织,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。GPX3蛋白的表达水平与肿瘤病理分期和淋巴结转移明显相关(P<0.05)。结论 :GPX3基因的表达异常在非小细胞肺癌的发生、发展中起着重要的作用。

泪腺肿瘤组织中GPX3基因mRNA和蛋白的表达及其相关性

目的探讨GPX3基因mRNA和蛋白在泪腺上皮性肿瘤中的表达及其临床意义。方法采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和Western-blot技术,检测32例泪腺多形性腺瘤、28例泪腺腺样囊性癌及9例正常泪腺组织中的GPX3基因mRNA及蛋白的表达。结果 RT-PCR结果显示,GPX3 mRNA在正常泪腺组织、泪腺多形性腺瘤及泪腺腺样囊性癌中的表达量分别为:0.90±0.01、0.48±0.03、0.21±0.01,三组间差异有统计学意义(P<0.05)。Western-blot结果显示,GPX3蛋白在正常泪腺组织、泪腺多形性腺瘤及泪腺腺样囊性癌中的表达分别为1985.00±121.63、768.01±121.32、0,逐渐降低,三组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GPX3可能参与了泪腺肿瘤的发生、发展,可作为鉴别泪腺良、恶性疾病的一种辅助分子标记物。

GPX3基因甲基化是胰腺癌的潜在诊断标志物

目的 探讨谷胱甘肽过氧化物酶3(glutathione peroxidase 3,GPX3)基因启动子区在胰腺癌中的甲基化情况及其表达调控机制。方法 应用半定量RT-PCR、甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MPCR)和硫化测序(bisulfite sequencing,BSSQ)技术对6株人胰腺癌细胞系(PANC-1、PANC3.11、MIAPaCa-2、SW1990、AsPC-1和CFPAC-1)和153例胰腺癌组织进行分析。结果GPX3在PANC-1、PANC3.11和SW1990细胞中高表达,其启动子区呈现非甲基化状态;在CFPAC-1细胞中低表达,其启动子区呈现部分甲基化状态;在MIAPaCa-2和AsPC-1细胞中缺失表达,其启动子区呈现完全甲基化。应用去甲基化试剂5-aza处理后,PANC-1、PANC3.11和SW1990细胞中表达无变化,CFPAC-1细胞中表达增加,MIAPaCa-2和AsPC-1细胞中恢复表达。结果表明GPX3的表达受启动子区甲基化调控。BSSQ结果进一步验证了其在细胞系中的状态和MSP的扩增效率。GPX3在胰腺癌中的甲基化率为26.1%(40/153),GPX3甲基化与年龄、吸烟和肿瘤分化程度有相关性(P<0.05),与性别、肿瘤大小、TNM分期、饮酒等因素无相关性(P>0.05),GPX3甲基化是胰腺癌诊断的潜在标志物。结论 GPX3在胰腺癌中频繁发生甲基化,其表达受启动子区甲基化调控。

Ksp-Gpx1-klk1载体的构建及鉴定

目的构建含有肾组织特异性启动子(Ksp-cadherin)的Gpx1与klk1载体质粒,为下一步构建转基因动物、研究在动物模型体内表达和基因治疗提供基础。方法以KLK1cDNA、GPX1cDNA、Ksp-cadherinBAC为模板,PCR扩增获得人源Gpx1、KLK1、Ksp-cadherincDNA。PCR产物大小与预期结果一致,序列分析完全正确。选择多个相应酶切位点,分步将Ksp-cadherin、Gpx1、KLK1插入至pIRES-EGFP质粒中,构建pKSP-GPX1-IRES-KLK1重组质粒。应用酶切鉴定和序列分析方法验证所构建载体的正确性。结果成功构建了含有Ksp-cadherin的Gpx1与klk1载体质粒。结论该重组载体的构建为下一步构建转基因动物,研究其在哺乳动物肾组织内过表达及在移植肾缺血再灌注损伤的基因治疗中的作用奠定了基础。