绿豆GR基因生物信息学分析及其CRISPR/Cas9重组载体的构建与转化

绿豆(Vigna radiata L.)是一种严格闭花授粉作物,其人工授粉效率低、成本高,通过杂交获取新品种较为困难。目前,国内外绿豆遗传转化体系鲜见报道,这极大地限制了绿豆基因功能的研究和新品种的开发,因此尝试建立绿豆遗传转化途径具有重要意义。首先对绿豆谷胱甘肽还原酶基因(GR)进行生物信息学分析,并以此为基础,构建基因编辑重组体,同时进行发根农杆菌的遗传转化。结果表明,GR蛋白相对分子质量为58.38 kDa,稳定性较好,为亲水蛋白,有多个磷酸化位点,不含跨膜结构,定位于细胞质中,二级结构主要包括ɑ-螺旋和延伸链,且含有Pyr_redox_2和Pyr_redox_dim两个结构域;系统进化分析发现该蛋白与赤豆(Vigna angularis)亲缘关系最近。在此基础上构建四靶点CRISPR/Cas9-GR-gRNA基因编辑载体,通过发根农杆菌遗传转化绿豆子叶节获取毛状根20株,后经PCR检测获取阳性克隆毛状根12株,其毛状根转化率约为60%,其研究结果可为绿豆后续基因编辑研究奠定重要基础。

GR基因片段的克隆和可诱导的目标载体的构建

为了构建针对小鼠糖皮质激素受体基因第２外显子的可诱导目标载体，我们对小鼠糖皮质激素受体基因第２外显子及其侧翼区域的基因组ＤＮＡ片段进行了结构分析，和部分片段的亚克隆，然后以ｐＦ１ｏｘ质粒为框架构建了可诱导的目标载体。这一载体的构建为进一步建立诱导型ＧＲ基因剔除小鼠奠定了基础，而且对于深入研究ＧＲ基因的表达调控也很有帮助。

棉花GR基因家族的全基因组鉴定及分析

【目的】谷胱甘肽还原酶基因(Glutathione reductase gene,GR)家族参与植物生长发育和非生物胁迫响应等生物进程,但其在棉花中的特性及功能尚不清楚。本研究通过在异源四倍体陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(G.barbadense)及其可能的二倍体祖先种亚洲棉(G.arboreum)和雷蒙德氏棉(G.raimondii)中对GR基因家族全基因组鉴定与特性分析,分析棉种分化及异源四倍体棉花形成过程中GR基因的进化历程,探讨其在非生物胁迫响应中的作用,为后续相关研究提供理论基础。【方法】利用生物信息学方法鉴定陆地棉、海岛棉、雷蒙德氏棉、亚洲棉的GR基因家族成员;解析GR基因家族成员的理化性质、序列特征、染色体位置、系统发育及表达模式。【结果】共鉴定到18个GR基因家族成员,陆地棉、海岛棉、雷蒙德氏棉和亚洲棉中GR基因数目分别为6、6、3和3个。系统发育分析发现GR基因分为2个亚组,同一亚组基因具有相似的外显子数目和基因结构。对同源基因的非同义突变率(Ka)及同义突变率(Ks)分析发现Ka/Ks值均小于1,表明在进化过程中GR基因经历了较强的纯化选择作用。陆地棉GR基因的表达模式分析表明,所有的GR基因均积极响应胁迫环境,但在不同的非生物胁迫下,基因的表达模式有明显差别。【结论】本研究探讨了GR基因家族在亚洲棉、雷蒙德氏棉、海岛棉和陆地棉基因组中的进化及功能,可为棉花GR基因后续研究提供理论基础。

GR6基因的结构特征以及在结直肠肿瘤中的表达

目的 :了解 GR6基因及其蛋白质产物 GR6假设蛋白的结构特征 ,以及 GR6基因在结直肠肿瘤中的表达改变。方法 :采用生物信息学的软件和数据库 ,分析 GR6基因的结构特点及其蛋白质产物 GR6假设蛋白的二级结构特征和功能特点等 ,并采用半定量逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)法 ,检测 39例结直肠癌组织和配对的远端切缘正常组织 ,以及 19例癌旁组织和 14例腺瘤组织中 GR6的转录表达水平。结果 :序列分析表明 ,GR6基因由 3个外显子组成 ,含有 4个 Cp G岛 ,编码产物为 14 9个氨基酸组成的 GR6假设蛋白。用生物信息学分析发现 ,GR6假设蛋白含有 1个蛋白激酶 C磷酸化位点 ,1个酪蛋白激酶 II磷酸化位点和 3个 N-肉豆蔻酸化位点及核定位信号 ,提示 GR6基因的表达产物可能是细胞核内的一种信号分子。m RNA水平上 ,GR6的转录表达水平从正常 -癌旁 -腺瘤 -腺癌逐步递减 ,其中 ,正常与腺瘤 (P<0 .0 5 )、正常与腺癌 (P<0 .0 1)的表达差异具有显著意义。结论 :GR6基因的表达产物即 GR6假设蛋白可能是细胞核内的一种信号分子。GR6基因在结直肠肿瘤中低表达 ,在结直肠肿瘤的发生、发展过程中可能起着重要的作用。

人糖皮质激素受体GR_α基因表达载体的构建和GR_α蛋白的表达

目前检测糖皮质激素受体采用的是放射配体法[1,2],存在着放射污染、实验结果不稳定、需血量大(6～7 ml)等问题,因此建立一种简便、无放射污染、需血量少、易于推广的检测方法显得很重要.而ELISA检测法基本符合以上条件.要建立ELISA检测法,首先须表达糖皮质激素受体蛋白.人糖皮质激素受体(hGR)有hGRα和hGRβ两种不同的蛋白,hGRα可与糖皮质激素结合而发挥生理作用,而hGRβ不能与糖皮质激素结合,因此无生理活性[3,4].目前hGRα蛋白的表达多采用真核细胞表达,此种表达方式虽能保持蛋白的天然空间结构而具有生理活性,但要大量制备并纯化却存在困难.本研究拟构建可诱导的hGRα基因表达载体,并大量表达hGRα蛋白,为hGRα ELISA检测法的建立奠定基础.

多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及分析

以盐胁迫处理的多枝赖草(Leymus multicaulis)植株新鲜叶片为材料,根据其他植物谷胱甘肽还原酶(GR)氨基酸保守区序列设计简并引物,通过RT—PCR扩增到1个408 bp的cDNA片段(Genbank注册号为 AY781786);利用DNAMAN软件将5’和3’RACE获得的5’和3’端序列,拼接成1个全长1 580 bp的cDNA序列,其包含1个1 140 bp的开放阅读框架,该阅读框架编码380个氨基酸;多枝赖草谷胱甘肽还原酶氨基酸序列与其他植物的同源性为77％～92％,定量PCR结果表明,GR基因的表达随着盐胁迫时间和盐浓度的增加而加强。

糖皮质激素受体基因内含子7长度多态性与猪脂肪性状相关研究

应用特异PCR技术检测了猪糖皮质激素受体（GR）基因内含子7长度多态性,并分析其与脂肪性状的相关性。结果表明：凉伞猪、龙潭猪群体中,GR基因内含子7长度多态性发现有A和B2个等位基因存在,该2种等位基因A/B频率在2个群体中分别为0.2286/0.7714和0.2008/0.7992。B等位基因是群体中的优势等位基因,该基因座在2个群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。建立混合模型方程组分析该长度多态对猪脂肪性状的效应,结果显示,猪GR基因内含子7长度多态的不同基因型与肌内脂肪、肩部膘厚、腰部膘厚、6~7肋膘厚、板油质量等性状显著相关（P〈0.05）。表明猪GR基因内含子7长度多态对猪脂肪沉积有一定的影响。

糖皮质激素受体基因片段的克隆和目标载体的构建

目的：构建针对糖皮质激素受体（ＧＲ）基因第２ 外显子的目标载体，为获得糖皮质激素受体基因缺陷型胚胎干细胞准备条件。方法：通过限制性酶切对ＤＮＡ片段进行了结构分析，克隆相应ＤＮＡ片段进行ＤＮＡ 序列测定，利用ｐＴＫ－Ｎｅｏ 质粒框架和同源片段构建载体。结果：详细分析了ＧＲ基因第２ 外显子及其侧翼的基因组ＤＮＡ片段结构，克隆了同源片段，构建了目标载体。结论：这一载体的构建将为进一步建立ＧＲ基因剔除小鼠奠定基础。

糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23多态性与支气管哮喘的相关性研究

目的检测糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor,GR)基因外显子2/1密码子23多态性,从而探讨糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23与激素敏感型支气管哮喘的相关性。方法按标准方法从外周血白细胞中提取DNA,采用聚合酶链反应/单链构象多态性(Polymerase chain reaction/Single-strand conformation polymor-phism,PCR/SSCP)和基因测序技术,结合琼脂糖凝胶电泳,对20例哮喘患者(研究组)及20例健康对照组的糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23的基因型进行检测和分类。统计两组的各基因型频率,判断两组之间有无差异。统计学处理用χ2检验。结果经琼脂糖凝胶电泳显示哮喘组(20例)与健康对照组(20例)样本PCR产物片断长度约356 bp。SSCP分析显示哮喘组(20例)与健康对照组(20例)样本的电泳速率相同,提示无变异存在。行基因测序糖皮质激素受体外显子2/1密码子23基因型均为AGG。结论江西籍汉族人种中糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23基因未发现多态性的存在。糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23与激素敏感型支气管哮喘之间无明显联系。

逆境胁迫对油菜谷胱甘肽还原酶基因表达及其酶活性的影响

利用cDNA末端快速分离(RACE)技术从陇油6号油菜中克隆得到一个新的谷胱甘肽还原酶基因GR2,全长2073 bp,开放阅读框1692 bp,编码563个氨基酸,预测蛋白质分子量为60.7 kDa,等电点7.9.实时荧光定量PCR分析表明:GR2基因在油菜根、茎、叶中均有表达,其中在叶中表达量最高.GR1和GR2基因的转录以及谷胱甘肽还原酶(GR)活性受到低温、高温、干旱、高盐胁迫的诱导,表明油菜谷胱甘肽还原酶在抵御低温、高温、干旱、高盐胁迫过程中发挥重要作用.脱落酸(ABA)预处理后再进行上述胁迫处理,与单独上述胁迫相比,GR1和GR2基因的转录以及GR活性水平明显上升,表明ABA可以诱导GR1和GR2基因表达和GR酶活性.MAPKK抑制剂U0126预处理后再进行上述胁迫处理,与单独上述胁迫相比,GR1和GR2基因的转录以及GR活性水平明显下降,表明U0126对GR1、GR2基因表达以及GR酶活性有抑制作用.

氯化镧对大鼠大脑皮质即早基因表达的影响

目的研究大鼠生长发育期氯化镧(lanthanum chloride,LaCl3)暴露对大鼠大脑学习记忆能力和皮质即刻早期基因c-jun、egr1和Arc表达的影响。方法将40只Wistar孕鼠随机分为饮用0.25%、0.5%、1.0%LaCl3蒸馏水溶液的3个染毒组和饮用蒸馏水的对照组。染毒组仔鼠断乳后继续分别自行饮用0.25%、0.5%和1.0%LaCl3蒸馏水溶液1个月。采用水迷宫试验测试仔鼠的学习记忆能力,采用电感耦合等离子体质谱仪测定仔鼠大脑皮质镧含量,采用RT-PCR法检测仔鼠大脑皮质c-jun、egr1和Arc mRNA表达,采用western blot法检测仔鼠大脑皮质c-jun、egr1和Arc蛋白的表达。结果水迷宫测试结果表明,0.25%、0.5%LaCl3组仔鼠错误次数和逃逸潜伏期明显高于对照组,1.0%LaCl3组仔鼠错误次数和逃逸潜伏期明显高于对照组和0.25%LaCl3组,且错误次数明显高于0.5%LaCl3组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。镧在仔鼠大脑皮质中的蓄积量随着LaCl3染毒浓度的增加而增加。此外,0.25%、0.5%LaCl3组仔鼠大脑皮质c-jun和egr1 mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组,1.0%LaCl3组仔鼠大脑皮质c-jun mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组和0.25%LaCl3组,且egr1 mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组和0.25%、0.5%LaCl3组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论生长发育期LaCl3暴露可影响大鼠在水迷宫中的学习记忆能力,其机制可能与大脑皮质即早基因c-jun和egr1基因和蛋白表达降低有关。