绿豆GR基因生物信息学分析及其CRISPR/Cas9重组载体的构建与转化

绿豆(Vigna radiata L.)是一种严格闭花授粉作物,其人工授粉效率低、成本高,通过杂交获取新品种较为困难。目前,国内外绿豆遗传转化体系鲜见报道,这极大地限制了绿豆基因功能的研究和新品种的开发,因此尝试建立绿豆遗传转化途径具有重要意义。首先对绿豆谷胱甘肽还原酶基因(GR)进行生物信息学分析,并以此为基础,构建基因编辑重组体,同时进行发根农杆菌的遗传转化。结果表明,GR蛋白相对分子质量为58.38 kDa,稳定性较好,为亲水蛋白,有多个磷酸化位点,不含跨膜结构,定位于细胞质中,二级结构主要包括ɑ-螺旋和延伸链,且含有Pyr_redox_2和Pyr_redox_dim两个结构域;系统进化分析发现该蛋白与赤豆(Vigna angularis)亲缘关系最近。在此基础上构建四靶点CRISPR/Cas9-GR-gRNA基因编辑载体,通过发根农杆菌遗传转化绿豆子叶节获取毛状根20株,后经PCR检测获取阳性克隆毛状根12株,其毛状根转化率约为60%,其研究结果可为绿豆后续基因编辑研究奠定重要基础。

GR基因片段的克隆和可诱导的目标载体的构建

为了构建针对小鼠糖皮质激素受体基因第２外显子的可诱导目标载体，我们对小鼠糖皮质激素受体基因第２外显子及其侧翼区域的基因组ＤＮＡ片段进行了结构分析，和部分片段的亚克隆，然后以ｐＦ１ｏｘ质粒为框架构建了可诱导的目标载体。这一载体的构建为进一步建立诱导型ＧＲ基因剔除小鼠奠定了基础，而且对于深入研究ＧＲ基因的表达调控也很有帮助。

棉花GR基因家族的全基因组鉴定及分析

【目的】谷胱甘肽还原酶基因(Glutathione reductase gene,GR)家族参与植物生长发育和非生物胁迫响应等生物进程,但其在棉花中的特性及功能尚不清楚。本研究通过在异源四倍体陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(G.barbadense)及其可能的二倍体祖先种亚洲棉(G.arboreum)和雷蒙德氏棉(G.raimondii)中对GR基因家族全基因组鉴定与特性分析,分析棉种分化及异源四倍体棉花形成过程中GR基因的进化历程,探讨其在非生物胁迫响应中的作用,为后续相关研究提供理论基础。【方法】利用生物信息学方法鉴定陆地棉、海岛棉、雷蒙德氏棉、亚洲棉的GR基因家族成员;解析GR基因家族成员的理化性质、序列特征、染色体位置、系统发育及表达模式。【结果】共鉴定到18个GR基因家族成员,陆地棉、海岛棉、雷蒙德氏棉和亚洲棉中GR基因数目分别为6、6、3和3个。系统发育分析发现GR基因分为2个亚组,同一亚组基因具有相似的外显子数目和基因结构。对同源基因的非同义突变率(Ka)及同义突变率(Ks)分析发现Ka/Ks值均小于1,表明在进化过程中GR基因经历了较强的纯化选择作用。陆地棉GR基因的表达模式分析表明,所有的GR基因均积极响应胁迫环境,但在不同的非生物胁迫下,基因的表达模式有明显差别。【结论】本研究探讨了GR基因家族在亚洲棉、雷蒙德氏棉、海岛棉和陆地棉基因组中的进化及功能,可为棉花GR基因后续研究提供理论基础。

陆地棉抗虫与抗草甘膦基因的分子聚合及经济性状相关分析

培育抗棉铃虫兼抗草甘膦的棉花,可以同步提高品种的抗虫与抗除草剂能力,降低植棉的除虫、除草用工成本,提升植棉综合经济效益。本研究利用自育的高产优质陆地棉品系、国产转Bt基因抗虫棉品系以及转GR79+GAT基因的抗草甘膦陆地棉品系为杂交亲本,配置复交组合。在繁殖的复交分离群体后代,通过在苗床喷洒0.2%草甘膦,去除不抗草甘膦棉苗;并在大田不防治棉铃虫的条件下,筛选抗虫棉株。而后在实验室利用特异引物对抗虫基因与抗草甘膦基因进行分子跟踪检测,将同时具有Bt基因与GR79+GAT基因的单株繁殖成株系,经大田筛选获得9个抗虫兼抗草甘膦的优良品系。然后对育成品系进行产量比较试验,结果显示,其中品系BG-6不但实现了抗虫与抗草甘膦基因的聚合,而且该品系的皮棉产量水平较高、纤维品质表现良好:纤维长度达30.9 cm、比强度30.1 cN tex^(-1)、马克隆值4.9。对产量性状与纤维品质性状相关分析显示,只有衣分与棉纤维整齐度呈极显著负相关(r=-0.838**),其他产量性状与纤维品质性状均不存在显著相关性。文章最后得出结论:在复合杂交组合的分离后代,通过在苗床喷洒草甘膦筛选抗性棉苗,再结合大田不治虫筛选抗虫单株;而后在室内对2种抗性基因进行PCR分子跟踪检测,再在大田对产量性状与品质性状进行系统选育,可实现抗虫与抗草甘膦基因以及高产与优质性状的多元聚合。

GR6基因的结构特征以及在结直肠肿瘤中的表达

目的 :了解 GR6基因及其蛋白质产物 GR6假设蛋白的结构特征 ,以及 GR6基因在结直肠肿瘤中的表达改变。方法 :采用生物信息学的软件和数据库 ,分析 GR6基因的结构特点及其蛋白质产物 GR6假设蛋白的二级结构特征和功能特点等 ,并采用半定量逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)法 ,检测 39例结直肠癌组织和配对的远端切缘正常组织 ,以及 19例癌旁组织和 14例腺瘤组织中 GR6的转录表达水平。结果 :序列分析表明 ,GR6基因由 3个外显子组成 ,含有 4个 Cp G岛 ,编码产物为 14 9个氨基酸组成的 GR6假设蛋白。用生物信息学分析发现 ,GR6假设蛋白含有 1个蛋白激酶 C磷酸化位点 ,1个酪蛋白激酶 II磷酸化位点和 3个 N-肉豆蔻酸化位点及核定位信号 ,提示 GR6基因的表达产物可能是细胞核内的一种信号分子。m RNA水平上 ,GR6的转录表达水平从正常 -癌旁 -腺瘤 -腺癌逐步递减 ,其中 ,正常与腺瘤 (P<0 .0 5 )、正常与腺癌 (P<0 .0 1)的表达差异具有显著意义。结论 :GR6基因的表达产物即 GR6假设蛋白可能是细胞核内的一种信号分子。GR6基因在结直肠肿瘤中低表达 ,在结直肠肿瘤的发生、发展过程中可能起着重要的作用。

人糖皮质激素受体GR_α基因表达载体的构建和GR_α蛋白的表达

目前检测糖皮质激素受体采用的是放射配体法[1,2],存在着放射污染、实验结果不稳定、需血量大(6～7 ml)等问题,因此建立一种简便、无放射污染、需血量少、易于推广的检测方法显得很重要.而ELISA检测法基本符合以上条件.要建立ELISA检测法,首先须表达糖皮质激素受体蛋白.人糖皮质激素受体(hGR)有hGRα和hGRβ两种不同的蛋白,hGRα可与糖皮质激素结合而发挥生理作用,而hGRβ不能与糖皮质激素结合,因此无生理活性[3,4].目前hGRα蛋白的表达多采用真核细胞表达,此种表达方式虽能保持蛋白的天然空间结构而具有生理活性,但要大量制备并纯化却存在困难.本研究拟构建可诱导的hGRα基因表达载体,并大量表达hGRα蛋白,为hGRα ELISA检测法的建立奠定基础.

多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及分析

以盐胁迫处理的多枝赖草(Leymus multicaulis)植株新鲜叶片为材料,根据其他植物谷胱甘肽还原酶(GR)氨基酸保守区序列设计简并引物,通过RT—PCR扩增到1个408 bp的cDNA片段(Genbank注册号为 AY781786);利用DNAMAN软件将5’和3’RACE获得的5’和3’端序列,拼接成1个全长1 580 bp的cDNA序列,其包含1个1 140 bp的开放阅读框架,该阅读框架编码380个氨基酸;多枝赖草谷胱甘肽还原酶氨基酸序列与其他植物的同源性为77％～92％,定量PCR结果表明,GR基因的表达随着盐胁迫时间和盐浓度的增加而加强。

糖皮质激素受体基因内含子7长度多态性与猪脂肪性状相关研究

应用特异PCR技术检测了猪糖皮质激素受体（GR）基因内含子7长度多态性,并分析其与脂肪性状的相关性。结果表明：凉伞猪、龙潭猪群体中,GR基因内含子7长度多态性发现有A和B2个等位基因存在,该2种等位基因A/B频率在2个群体中分别为0.2286/0.7714和0.2008/0.7992。B等位基因是群体中的优势等位基因,该基因座在2个群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。建立混合模型方程组分析该长度多态对猪脂肪性状的效应,结果显示,猪GR基因内含子7长度多态的不同基因型与肌内脂肪、肩部膘厚、腰部膘厚、6~7肋膘厚、板油质量等性状显著相关（P〈0.05）。表明猪GR基因内含子7长度多态对猪脂肪沉积有一定的影响。

糖皮质激素受体基因片段的克隆和目标载体的构建

目的：构建针对糖皮质激素受体（ＧＲ）基因第２ 外显子的目标载体，为获得糖皮质激素受体基因缺陷型胚胎干细胞准备条件。方法：通过限制性酶切对ＤＮＡ片段进行了结构分析，克隆相应ＤＮＡ片段进行ＤＮＡ 序列测定，利用ｐＴＫ－Ｎｅｏ 质粒框架和同源片段构建载体。结果：详细分析了ＧＲ基因第２ 外显子及其侧翼的基因组ＤＮＡ片段结构，克隆了同源片段，构建了目标载体。结论：这一载体的构建将为进一步建立ＧＲ基因剔除小鼠奠定基础。

糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23多态性与支气管哮喘的相关性研究

目的检测糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor,GR)基因外显子2/1密码子23多态性,从而探讨糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23与激素敏感型支气管哮喘的相关性。方法按标准方法从外周血白细胞中提取DNA,采用聚合酶链反应/单链构象多态性(Polymerase chain reaction/Single-strand conformation polymor-phism,PCR/SSCP)和基因测序技术,结合琼脂糖凝胶电泳,对20例哮喘患者(研究组)及20例健康对照组的糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23的基因型进行检测和分类。统计两组的各基因型频率,判断两组之间有无差异。统计学处理用χ2检验。结果经琼脂糖凝胶电泳显示哮喘组(20例)与健康对照组(20例)样本PCR产物片断长度约356 bp。SSCP分析显示哮喘组(20例)与健康对照组(20例)样本的电泳速率相同,提示无变异存在。行基因测序糖皮质激素受体外显子2/1密码子23基因型均为AGG。结论江西籍汉族人种中糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23基因未发现多态性的存在。糖皮质激素受体基因外显子2/1密码子23与激素敏感型支气管哮喘之间无明显联系。

逆境胁迫对油菜谷胱甘肽还原酶基因表达及其酶活性的影响

利用cDNA末端快速分离(RACE)技术从陇油6号油菜中克隆得到一个新的谷胱甘肽还原酶基因GR2,全长2073 bp,开放阅读框1692 bp,编码563个氨基酸,预测蛋白质分子量为60.7 kDa,等电点7.9.实时荧光定量PCR分析表明:GR2基因在油菜根、茎、叶中均有表达,其中在叶中表达量最高.GR1和GR2基因的转录以及谷胱甘肽还原酶(GR)活性受到低温、高温、干旱、高盐胁迫的诱导,表明油菜谷胱甘肽还原酶在抵御低温、高温、干旱、高盐胁迫过程中发挥重要作用.脱落酸(ABA)预处理后再进行上述胁迫处理,与单独上述胁迫相比,GR1和GR2基因的转录以及GR活性水平明显上升,表明ABA可以诱导GR1和GR2基因表达和GR酶活性.MAPKK抑制剂U0126预处理后再进行上述胁迫处理,与单独上述胁迫相比,GR1和GR2基因的转录以及GR活性水平明显下降,表明U0126对GR1、GR2基因表达以及GR酶活性有抑制作用.

氯化镧对大鼠大脑皮质即早基因表达的影响

目的研究大鼠生长发育期氯化镧(lanthanum chloride,LaCl3)暴露对大鼠大脑学习记忆能力和皮质即刻早期基因c-jun、egr1和Arc表达的影响。方法将40只Wistar孕鼠随机分为饮用0.25%、0.5%、1.0%LaCl3蒸馏水溶液的3个染毒组和饮用蒸馏水的对照组。染毒组仔鼠断乳后继续分别自行饮用0.25%、0.5%和1.0%LaCl3蒸馏水溶液1个月。采用水迷宫试验测试仔鼠的学习记忆能力,采用电感耦合等离子体质谱仪测定仔鼠大脑皮质镧含量,采用RT-PCR法检测仔鼠大脑皮质c-jun、egr1和Arc mRNA表达,采用western blot法检测仔鼠大脑皮质c-jun、egr1和Arc蛋白的表达。结果水迷宫测试结果表明,0.25%、0.5%LaCl3组仔鼠错误次数和逃逸潜伏期明显高于对照组,1.0%LaCl3组仔鼠错误次数和逃逸潜伏期明显高于对照组和0.25%LaCl3组,且错误次数明显高于0.5%LaCl3组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。镧在仔鼠大脑皮质中的蓄积量随着LaCl3染毒浓度的增加而增加。此外,0.25%、0.5%LaCl3组仔鼠大脑皮质c-jun和egr1 mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组,1.0%LaCl3组仔鼠大脑皮质c-jun mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组和0.25%LaCl3组,且egr1 mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组和0.25%、0.5%LaCl3组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论生长发育期LaCl3暴露可影响大鼠在水迷宫中的学习记忆能力,其机制可能与大脑皮质即早基因c-jun和egr1基因和蛋白表达降低有关。