匹多莫德增强弓形虫GRA1蛋白免疫效果的动物实验评价

目的:探讨匹多莫德增强弓形虫GRA1蛋白刺激机体产生免疫应答和保护免疫的效果。方法:匹多莫德和毕赤酵母菌表达的弓形虫GRA1蛋白混合皮下注射免疫小鼠,以PBS作对照,检测其细胞免疫和体液免疫,并观察其受到弓形虫攻击感染后的生存情况。结果:匹多莫德能辅助GRA1蛋白刺激宿主产生较高的细胞免疫和体液免疫,并能提供较好的免疫保护力。GRA1蛋白加匹多莫德组、GRA1蛋白加弗氏完全佐剂组小鼠IFNγ-、特异性IgG显著高于对照组(P<0.01)和GRA1蛋白组(P<0.01);各免疫组CD8+T细胞数量显著高于对照组(P<0.01);GRA1蛋白加匹多莫德组CD4+T细胞数量(P<0.01)、CD4+/CD8+比值显著高于其它免疫组(P<0.05)。各免疫组T细胞增殖活性与PBS对照组比较明显增强(P<0.01),GRA1蛋白加匹多莫德组T细胞增殖活性最明显。小鼠攻击试验表明,GRA1蛋白加匹多莫德组和GRA1蛋白加弗氏完全佐剂组小鼠存活时间明显长于对照组和GRA1蛋白组。结论:匹多莫德与弗氏佐剂具有相似增强免疫应答和提高GRA1蛋白抗原的免疫原性作用,可望用于弓形虫亚单位疫苗的研制。

弓形虫GRA1蛋白单克隆抗体的制备与间接免疫荧光检测方法的建立

本研究旨在利用原核表达系统表达弓形虫GRA1蛋白并制备单克隆抗体,用于弓形虫病的诊断及GRA1蛋白功能研究。以弓形虫cDNA为模板,设计引物扩增GRA1基因片段,构建原核表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达蛋白并纯化。用纯化后的重组蛋白作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体并鉴定。以制备的弓形虫GRA1单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,优化反应条件建立弓形虫间接免疫荧光检测方法。结果表明:成功构建了原核表达质粒pET-30a(+)-TG-GRA1;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白GRA1为可溶性表达,分子量约为27 kDa;Western blot结果显示重组蛋白GRA1可被犬弓形虫阳性血清识别,表明GRA1有良好的反应原性。成功筛选出5株单克隆细胞株,分别命名为1-B10、2-C3、2-C9、3-C11以及6-E6,并对它们进行亚型鉴定,其中2-C3、2-C9、3-C11为IgG1,1-B10、6-E6为IgM;IFA结果显示单克隆抗体具有良好的反应原性;建立了mAb 2-C9最佳稀释浓度为0.875μg/mL、最佳孵育时间为1.5 h,FITC标记的羊抗鼠IgG最佳稀释倍数为1∶400、最佳孵育时间为1.5 h的间接免疫荧光检测方法,并对15只小鼠的肝脏组织切片进行检测,结果表明该方法可用于弓形虫动物组织切片的检测,有助于弓形虫感染的实验室诊断及弓形虫的动态分布研究。

评价基于致密颗粒蛋白GRA1为抗原检测猫弓形虫感染的血清学诊断方法

为了研究以弓形虫致密颗粒蛋白GRA1为抗原检测猫弓形虫感染的血清学诊断及评价,试验采用标准弓形虫抗体阳性、阴性猫血清建立ELISA方法,最终确定重组GRA1最佳蛋白包被浓度为5μg/m L、血清最佳稀释度为1∶64,用此方法对已通过MAT/IFA法共同确定的185份猫弓形虫抗体血清进行检测并评价。结果表明:应用MAT/IFA法检出阳性血清39份、阴性血清146份,而通过重组GRA1-ELISA法检出阳性血清37份、阴性血清148份,二者共同检出阳性血清33份、阴性血清142份,GRA1假阳性率为10.8%,假阴性率为4.1%。比较重组GRA1-ELISA与MAT/IFA的结果,二者不一致部分无显著性差异(P>0.05);一致性部分经Kappa检验(K=0.83),一致率为94.6%。说明以重组GRA1作为包被抗原建立的ELISA方法检测效果没有弓形虫体裂解蛋白TLA好。因此,重组GRA1不是用于检测猫弓形虫感染的流行病学调查的最佳诊断抗原。

弓形虫强毒株和弱毒株致密颗粒蛋白1基因的比较研究

目的比较弓形虫强毒株RH株、桂弓株和弱毒株B36株致密颗粒蛋白1(GRA1)基因片段的异同。方法分别从接种RH株、桂弓株、B36株弓形虫的小鼠腹水中收集、纯化虫体,提取基因组DNA,PCR扩增3个虫株的致密颗粒蛋白1(GRA1)目的基因片段;构建pMD-18-T/GRA1重组质粒,PCR和双酶切鉴定其准确性;测序并用NCBI中Blast软件和MEGA3.1软件分析比较3种不同毒力株GRA1基因的异同。结果获得3株弓形虫的GRA1目的基因片段并构建了pMD-18-T/GRA1重组质粒,经鉴定目的基因片段大小与预期理论值相符。测序分析3不同毒力株GRA1基因片段相似为100%。结论弓形虫强毒株RH株、桂弓株和弱毒株B36株的GRA1基因片段极其相似,且高度保守。因此认为弓形虫GRA1基因具有较高应用价值。