弓形虫GRA7基因的保守性鉴定

目的 比较弓形虫不同地理株 (RH株、ZS2株、GT株 ) GRA7基因的异同。方法 运用 PCR从弓形虫不同地理株的基因组 DNA中扩增出 GRA7基因 ,对 GRA7基因用限制性内切酶(Esp3I、Cfr I、Mbo I)酶切并比较。将 GRA7基因克隆至 p GEX- 4 T- 1质粒 ,转化大肠杆菌 JM10 9,进行测序并比较。结果 PCR扩增出 3株弓形虫的目的基因片段大小均在 5 0 0 bp- 75 0 bp之间 ,约711bp。 3种限制性内切酶酶切片段的大小均与理论值相符。 3株弓形虫 GRA7基因序列相同。结论 弓形虫不同地理株 GRA7基因具有高度保守性。

3株弓形虫GRA7基因的保守性鉴定

目的 比较弓形虫不同地理株 (RH株、ZS2株、GT株 )GRA7基因的异同。 方法 从弓形虫不同地理株的基因组DNA中扩增出GRA7基因 ,对目的基因用限制性内切酶 (Esp3I、CfrI、MboI)酶切并比较。将目的基因克隆至pGEX 4T 1质粒 ,转化大肠埃希菌JM 10 9,进行测序并比较。 结果 PCR扩增出 3株弓形虫的目的基因片段 ,大小均在 5 0 0～ 75 0bp之间 ;经 3种限制性内切酶酶切 ,其大小均与理论值相符 ;3株弓形虫GRA7基因序列相同。

3株不同宿主源弓形虫分离株GRA7基因的克隆与序列分析

对分离于江苏地域的3株不同宿主源弓形虫YZ-1(ChineseⅠ基因型)、YZ-2(ChineseⅠ基因型)和KS(基因型Ⅰ型)分离株的GRA7基因的全长序列进行克隆与序列分析,结合GenBank中的相关序列进行遗传进化分析。结果表明:KS株的GRA7基因完整开放阅读框长711 bp,与RH参考株完全一致;YZ-1和YZ-2株GRA7基因序列均为708 bp,与KS株相比在290-292位点缺失3个碱基;氨基酸序列和抗原表位分析显示,YZ-1和YZ-2株的GRA7蛋白在97位缺失1个谷氨酸,但比KS和RH株多1个抗原表位。结果表明,GRA7基因可区分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型虫株,ChineseⅠ型与Ⅱ型虫株的亲缘关系最近;ChineseⅠ型GRA7基因在290-292位点缺少3个碱基,其GRA7蛋白多1个抗原表位。

不同基因型弓形虫GRA7重组蛋白的抗原性鉴定及交叉反应原性分析

弓形虫是一种严重危害公共卫生安全的人兽共患寄生原虫。前期研究发现,相对于弓形虫Ⅰ型株(RH株),ChineseⅠ型株(YZ-2株)GRA7蛋白因缺失1个谷氨酸而形成新的抗原表位,但该表位对GRA7蛋白免疫学功能的影响尚不清楚。分别对弓形虫RH和YZ-2株GRA7基因进行PCR扩增,构建原核表达载体RH-pET30a(+)-GRA7和YZ-2-pET30a(+)-GRA7,并进行体外诱导表达;Western blot分析2种重组蛋白的抗原性及交叉反应原性。结果表明:GRA7基因PCR产物大小630~633 bp;体外诱导表达产物大小约37 ku;2种重组蛋白均能被抗His标签单克隆抗体、GRA7重组蛋白制备的鼠多克隆抗体以及弓形虫速殖子可溶性抗原制备的鼠多克隆抗体所识别;同时,用重组蛋白制备的多克隆抗体可交叉识别2种基因型虫体内的GRA7天然蛋白。Ⅰ型和ChineseⅠ型虫株的GRA7蛋白具有良好的交叉反应原性,该结果为进一步探索弓形虫GRA7蛋白的功能及其抗感染免疫保护作用的研究奠定基础。

弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白基因的序列分析及其在大肠埃希菌中的表达

目的分析弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白7(densegranuleprotein,GRA7)基因的异同及在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白。方法从弓形虫不同分离株(RH株、ZS2株和GT株)的基因组中特异地扩增出GRA7基因,将目的基因定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠埃希菌JM109并测序。利用互联网上的在线工具CLUSTALW进行序列分析。异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)体外诱导pGEX-4T-1/GRA7重组质粒菌的表达,对表达的目的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),分别以抗抗谷胱甘肽巯基转移酶(GST)抗体、人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Westernblotting分析。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,ELISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果弓形虫不同分离株GRA7的基因序列相同;pGEX-4T-1/GRA7重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,Westernblotting分析表明该蛋白为GST融合蛋白,且能被人抗弓形虫阳性血清所识别;ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫不同分离株GRA7基因具有高度保守性;GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达,且该重组蛋白具有一定免疫反应性。