弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物 ,采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段 ,克隆至 pMD18-T载体 ;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析 ;各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX - 4T - 2和真核表达载体 pVAX1,分别转化大肠杆菌BL2 1和JM10 9,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列 ;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达 ;将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠 ,观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段 ,各组阳性克隆的序列正确 ,并分别被亚克隆到原核表达质粒 pGEX - 4T - 2和真核表达载体pVAX1上 ,构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒 ;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白 ;真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论 以pGEX - 4T - 2和 pVAX1为载体 ,分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒。

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8截短型片段在原核中的表达

目的构建弓形虫GRA8原核重组表达质粒,分析其表达状况。方法采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列,经克隆后,亚克隆至原核表达载体中,构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒,分析GRA8的表达;将各重组菌进行诱导,将裂解上清用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化目的蛋白,免疫印迹法(Westernblotting)分析纯化蛋白的活性。结果GRA8基因被正确插入原核表达质粒中,原核重组表达质粒在大肠埃希菌JM109中表达GRA8的水平低,几乎无完整GRA8的表达,截短型GRA8经谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-PAGE获得纯化。纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别。结论GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低,纯化的截短型GRA8具一定的抗原反应性。

弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒。方法设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAC而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况。结果PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达。结论成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8。

弓形虫GRA8基因真核表达重组质粒的构建、鉴定及测序

目的 构建弓形虫RH株 pcDNA3 .1( + ) GRA8真核表达重组质粒 ,为进一步DNA免疫做准备。方法 用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码致密颗粒蛋白(GRA8)的基因片段 ,纯化后重组入 pUC 19克隆载体 ,再经含IPTG ,XGal氨苄培养基蓝白筛选 ,挑选白色克隆酶切 ,低溶点琼脂糖纯化 ,回收目的基因亚克隆入pcDNA3 .1( + ) ,经氨苄培养基过夜培养挑选 6个克隆提纯酶切 ,PCR鉴定和测序。结果 从RH株基因组DNA中扩增出特异的GRA 8基因片段 ,克隆成功pcDNA3 .1( + ) GRA 8重组质粒。测序表明GRA8这部分基因与GENEBANK相应基因序列完全一致。

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核重组表达质粒的体外表达分析

目的:分析弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核表达质粒的体外表达。方法:大量提取纯化重组真核表达质粒pVAX1-GRA8,瞬时转染培养的vero E-6细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测GRA8在细胞中的表达。结果:从转染pVAX1-GRA8后的vero E-6细胞的RNA中扩增出GRA8的特异条带,转染细胞存在弓形虫感染血清识别的特异蛋白质条带。结论:真核表达质粒pVAX1-GRA8在vero E6细胞中获得表达。