PAK1在幽门螺杆菌联合MNNG诱导人食管上皮细胞分泌IL-8和GRO-α中的作用

目的构建PAK1低、高表达人食管上皮细胞(HEEC)稳定细胞株,探究PAK1在幽门螺杆菌(HP)联合N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导HEEC分泌趋化因子IL-8和GRO-α中的作用,为食管癌发病机制提供理论依据。方法利用RNAi技术转染HEEC构建PAK1低表达(PAK1-KD)稳定细胞株,利用过表达慢病毒转染HEEC构建PAK1高表达(PAK1-OE)稳定细胞株;两种细胞分别分为HP+MNNG染毒组、HP染毒组和MNNG染毒组,并设立空白对照组。按感染复数(MOI)=100∶1,即细菌∶细胞=100∶1将HP加入细胞中进行共培养,采用CCK8法计算MNNG半数抑制浓度(IC50)。收集染毒后3 h、6 h和9 h的细胞上清液,采用ELISA法测定IL-8和GRO-α含量。结果相较于空载体对照组(PAK1-NC),PAK1-KD组PAK1基因敲减效率达到84.1%(t=14.627,P=0.004),PAK1-OE组PAK1基因的表达丰度是PAK1-NC组的1,101.646倍(t=16.104,P=0.004)。表明成功构建了PAK1低、高表达HEEC稳定细胞株。在PAK1-KD和PAK1-OE细胞中,各染毒组细胞IL-8和GRO-α分泌含量均随染毒时间呈趋势性增加(均P<0.01)。在PAK1-KD和PAK1-OE细胞中,相同染毒时间,各组细胞IL-8和GRO-α含量均出现联合染毒组>HP染毒组>MNNG染毒组>对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。在相同染毒时间内,与PAK1低表达(PAK1-KD)相比,PAK1高表达(PAK1-OE)显著促进联合染毒组、HP染毒组和MNNG染毒组细胞分泌IL-8和GRO-α,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论PAK1作为幽门螺杆菌感染上皮信号通路关键因子,其高表达可促进HP联合MNNG染毒诱导人食管上皮细胞分泌趋化因子IL-8和GRO-α,在食管癌发生中起重要作用。

GRO-α的原核表达及对细胞增殖作用的初步研究

目的:构建含有GRO-α(生长调节癌基因-1)的重组表达载体,优化重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中表达,分析其对肿瘤细胞的增殖作用的影响。方法:RT-PCR扩增GRO-α基因片段,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot检测目的蛋白表达。经亲和层析柱纯化目的蛋白,作用于人乳腺癌细胞系MCF-7,应用CCK8检测其对细胞增殖的影响。结果:成功构建pGEX-4T-1/GRO-α原核表达质粒,高效表达GRO-α-GST融合蛋白,大小为34ku。细胞增殖实验结果显示,该蛋白对人乳腺癌细胞MCF-7增殖具有促进作用。结论:重组GRO-α-GST融合蛋白具有生物学活性,可促进人乳腺癌细胞的增殖,为今后制备相应抗体奠定基础并为乳腺癌的靶向治疗提供新的方法。

癌相关成纤维细胞通过Gro-α激活NF-кB核转位和VEGF表达促进卵巢癌的生长

背景与目的：卵巢癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）促进上皮肿瘤的发生，其分泌的趋化因子即生长调节致癌基因α（growth-regulated oncogene alpha，Gro-α）蛋白在肿瘤间质微环境中促进上皮卵巢癌的发生，但其作用机制并不清楚。本研究拟测定Gro-α蛋白是否通过激活间质成纤维细胞中NF-кB核转位和VEGF表达，促进卵巢癌的生长。方法：本研究采用ELISA法测定了两株卵巢癌CAF和两株正常卵巢组织成纤维细胞（normal fibroblasts，NF）条件培养基（conditioned medium，CM）中Gro-α的表达；用CAF-CM或Gro-α分别处理NF，并以NF-кB抑制剂处理作为对照；用蛋白质印迹法（Western blot）测定样品处理前后NF-кB和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等分子的变化；然后用CAF或NF分别与卵巢癌细胞系OVCA429混合接种BALB/c裸小鼠，或在有、无NF-кB抑制剂PS1145处理的NF中，用CAF-CM或Gro-α处理后，分别与OVCA429混合接种动物，观察和比较动物移植瘤生长及移植瘤组织中微血管形成情况。结果：Gro-α在CAF中比在NF中高5-6倍；与对照组相比，用CAF条件培养基或Gro-α处理的NF中NF-кB p65的核转位升高，且VEGF上升，但血管生成抑制因子-血小板反应蛋白1下降；用NF-кB抑制剂同时处理NF，可以逆转其VEGF和TSP-1的表达水平；动物试验结果发现CAF要比NF更易促进肿瘤生长，而CAF-CM或Gro-α处理的NF细胞可以促进动物移植瘤的快速增长和移植瘤组织中微血管的生成，但用NF-кB抑制剂处理的NF则抑制肿瘤生长和血管形成能力。结论：卵巢癌CAF在肿瘤微环境中通过自分泌Gro-α，激活NF-кB核转位和VEGF表达，促进卵巢癌组织血管增生和肿瘤的生长。

生长调节致癌基因GRO-1在肝癌预后中的意义及初步机制

【目的】探讨生长调节致癌基因-1（GRO-1）在肝癌预后中的意义，同时初步研究其作用机制。【方法】收集179例首次行根治性切除的肝癌患者的血清，根据收集病例的顺序，前103个病例进入检测组，后76个病例进入验证组。应用人类细胞因子磁珠面板测定了血清中GRO-1的表达水平。同时检测5株肝癌细胞系MHCC-97H、QGY-7703、SMMC7721、Hep3B及CRl2234中GRO-1的分泌水平，并用MTS及Transwell检测GRO-1中和抗体对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。【结果】GRO-1的分泌水平为23～1553pg／mL，中位数为300pg／mL。在检测组中，应用ROC曲线计算GRO-1对复发的最大临界值。单因素分析发现GRO-1是影响患者术后无瘤生存的危险因素。在验证组中应用检测组的最大临界值发现，GRO-1仍是影响患者术后无瘤生存的危险因素。多因素分析发现肿瘤直径、播散结节和GRO-1可以作为判断肝癌患者无瘤生存的独立预后因素。肝癌细胞中仅Hep3B及CRL2234分泌GRO-1。GRO-1中和抗体能有效抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其抑制作用呈浓度依赖性。【结论】GRO-1在肝癌增殖、侵袭及转移中发挥着重要的作用，是预测肝癌术后复发的独立风险因素。

GRO-α和CMTM-8在宫颈癌发病机制中的作用

目的探讨趋化因子GRO-α和趋化素样因子超家族-8(CMTM-8)在宫颈癌中的发病机制。方法选择46例宫颈癌组织为宫颈癌组,癌旁正常组织为对照组;免疫组化方法检测GRO-α和CMTM-8的表达。结果宫颈癌组GRO-α蛋白的阳性率显著高于对照组,CMTM-8蛋白的阳性率显著低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);在宫颈癌组中,GRO-α表达的阳性率与肿瘤的发生及淋巴结转移有关(P<0.05),而与分化程度、临床分期无明显关系(P>0.05);CMTM-8表达的阳性率与肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移均有显著关系(P<0.05);GRO-α和CMTM-8表达呈负相关(r=-0.46,P<0.05)。结论宫颈癌组织中GRO-α蛋白表达水平增加,而CMTM-8表达下降,两者呈负相关,它们可能参与宫颈癌的生物进程,故针对GRO-α和CMTM-8的免疫治疗有一定的应用前景,值得进一步研究。

GRO-1和CXCR2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的探讨GRO-1和CXCR2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义。方法收集医院胸外科有病理标本的非小细胞肺癌患者100例作为研究组。同时选择医院有明确病理标本、肺部良性肿瘤患者100例作为对照组。对比研究组和对照组病理组织中GRO-1及CXCR2阳性表达情况,比较研究组肺癌组织及癌旁组织中GRO-1及CXCR2阳性表达情况,观察研究组不同病理类型、分化程度及病理情况者GRO-1及CXCR2阳性表达情况。结果研究组病理组织中GRO-1及CXCR2阳性率均高于对照组,差异有统计学意义(P <0. 05)。研究组肺癌组织中GRO-1及CXCR2的阳性表达率明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(P <0. 05)。不同病理类型和淋巴结转移数肿瘤患者的GRO-1及CXCR2阳性表达情况比较差异无统计学意义(P> 0. 05);不同分化程度及肿瘤期别患者的GRO-1及CXCR2阳性表达情况存在差异,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论低分化非小细胞肺癌患者GRO-1和CXCR2表达情况明显高于高分化及中分化患者,Ⅲ期患者GRO-1和CXCR2表达情况明显高于Ⅰ期和Ⅱ期患者,这为临床医师分析非小细胞肺癌的治疗提供一定思路。