快速筛选高水平稳定表达成纤维细胞生长因子-21真核细胞株新方法的建立

成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员,其研究已成为世界糖尿病研究的新热点,并有望成为治疗2型糖尿病的新型药物.然而,应用真核表达系统,更加快速、高效生产更接近天然状态的FGF-21蛋白并对其生物学功能进行的研究,至今尚未报道,因此建立高效稳定的FGF-21真核表达系统至关重要.本研究以FGF-21为目的基因,利用谷氨酰胺合成酶基因(GS)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,分别构建了单基因表达载体Pee12.4-FGF-21-Pee6.4-EGFP(Peedual)、Pee12.4-FGF-21-IRES-EGFP(PeeIRES)和双基因的真核表达载体Pee12.4-FGF-21-IRES-EGFP-Pee6.4-FGF-21(Peedual-IRES),分别转染CHO-K1SV细胞后,通过GS加压和流式细胞术(在488 nm波长的激发光下能检测到EGFP绿色荧光)双筛选系统快速有效获得了稳定高效表达目的蛋白的细胞系.应用SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测细胞系目的蛋白的表达及差异,并通过HepG-2细胞糖吸收模型进行蛋白活性检测.研究结果表明:两个筛选系统结合使用,更好更快地筛选到了稳定转染并高效表达目的蛋白的细胞系,而且与单基因的载体相比,双基因载体Peedual-IRES在操作条件一致的情况下,目的蛋白表达量显著提高且均具有生物活性.本研究建立了省时、高效的真核表达平台,为FGF-21在真核水平上的高表达提供了一个新的方法.

rhGH-Fc工程细胞的构建及筛选

目的研制具有较长半衰期的长效重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH),构建并筛选出高表达rhGH-Fc免疫融合蛋白的细胞株。方法将hGH基因与特异位点突变后的人抗体IgG4Fc段用柔性linker连接,克隆至GS双表达载体上,构建重组表达质粒,经两次双酶切鉴定及测序分析后,将构建正确的质粒稳定转染CHO-k1细胞。通过逐渐提高蛋氨酸磺酰胺(methionine sulphoximine,MSX)浓度,ELISA法筛选高表达的细胞株;利用亲和层析初步纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE、HPLC、等电聚焦电泳分析;通过大鼠去垂体法测定长效rhGH的生物学活性,比较本课题研制的长效GH与其他普通GH的半衰期。结果重组质粒phGH-Fc-1经两次双酶切及测序鉴定,证明构建正确;成功筛选出高表达rhGH-Fc融合蛋白的细胞株,表达量可达1g/L;纯化的目的蛋白相对分子质量大小及等电点均与理论值一致,纯度可达95%以上;经大鼠去垂体体内活性测定,其比活为1.1IU/mg,依大鼠体重增长情况判断,其生物半衰期高于普通rhGH。结论成功构建并筛选出高表达长效rhGH的工程株,为后续长效rhGH的研制奠定了基础。