茯苓多糖通过SQLE/NLRP3/GSDMD信号通路调控肝癌细胞焦亡

目的:应用生物信息学分析技术初步探索肝细胞癌(HCC)脂代谢异常差异表达基因,并结合实验验证,探讨茯苓多糖通过角鲨烯环氧酶(SQLE)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/消皮素D(GSDMD)信号通路影响细胞焦亡的分子机制。方法:(1)利用GEO、GSEA、DAVID、STRING和GEPIA数据库筛选HCC脂代谢异常差异表达基因。(2)收集HCC患者肿瘤组织(n=9)验证SQLE基因的差异表达。(3)培养人HCC细胞系HepG2,采用CCK-8法筛选茯苓多糖浓度。(4)将HepG2细胞分为对照组和茯苓多糖(800 mg/L)组,划痕实验观察细胞迁移能力,RT-qPCR检测细胞中SQLE的mRNA表达水平。(5)进一步采用构建过表达SQLE(OE-SQLE)的HepG2细胞,再用茯苓多糖处理,分为5组:对照组、过表达阴性对照(OE-NC)组、OE-SQLE组、OE-NC+茯苓多糖组和OESQLE+茯苓多糖组。RT-qPCR和Western blot检测SQLE和焦亡相关因子的mRNA及蛋白表达水平;比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性;ELISA法检测白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18释放水平;流式细胞术检测细胞坏死水平。结果:生物信息学分析筛选出差异表达基因SQLE。HCC患者肿瘤标本验证SQLE的mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。800 mg/L茯苓多糖干预48 h对HepG2细胞活力具有显著抑制作用,且可显著降低SQLE的mRNA表达水平(P<0.01)。SQLE过表达后,焦亡相关因子的mRNA和蛋白表达水平、细胞坏死水平,以及LDH、IL-1β和IL-18释放水平均显著降低(P<0.05);茯苓多糖干预后,上述指标均显著升高(P<0.05)。结论:SQLE在HCC中异常高表达;茯苓多糖可通过SQLE激活NLRP3/GSDMD焦亡通路,从而影响HCC细胞生长。

基于TXNIP/GSDMD通路探讨补阳还五汤抑制高血压病大鼠内皮焦亡作用机制

目的通过观察补阳还五汤对高血压病大鼠硫氧还蛋白互作蛋白-消皮素D(TXNIP/GSDMD)信号转导通路的影响,从焦亡角度探讨补阳还五汤对高血压病大鼠主动脉血管内皮损伤的保护机制。方法将大鼠随机分为空白对照组,模型组,补阳还五汤低、中、高剂量组,氢氯噻嗪组,每组10只,所有大鼠于SPF级动物实验中心普通饲料适应性饲养7 d。空白对照组每日给予低盐饲料喂养,其余各组采用高盐饲料喂养,同时,补阳还五汤低、中、高剂量组分别以0.275、0.55、1.1 g/mL浓度中药干预,氢氯噻嗪组以10 mg/(kg·d)浓度药物干预。3周后,观察到大鼠血压比造模前升高大于或等于30 mm Hg(1 mm Hg≈0.133 kPa),且收缩压(SBP)≥160 mm Hg即高血压病大鼠造模成功。取大鼠主动脉进行检测,HE染色观察大鼠主动脉病理形态改变;采用ELISA检测大鼠主动脉中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素1β(IL-1β)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)蛋白表达;荧光定量PCR检测大鼠主动脉中TXNIP、GSDMD、还原性辅酶Ⅱ氧化酶4(NOX4)、IL-1β的mRNA表达,免疫印迹实验(Western blot)检测大鼠主动脉中GSDMD的蛋白表达,免疫组化(IHC)检测大鼠主动脉中TXNIP、NOD样受体蛋白3(NLRP3)、GSDMD的蛋白表达。结果与空白对照组相比,模型组大鼠血压明显升高,主动脉内外膜都有一定脱落,界线模糊,血管中膜弹性纤维结构比较疏松,排列有一定紊乱;TXNIP、GSDMD、IL-1β、NOX4的mRNA表达上升(P<0.05);TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、IL-18、AngⅡ、MDA的蛋白表达升高(P<0.05),SOD蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组相比,补阳还五汤中剂量组和氢氯噻嗪组大鼠血压明显降低,血管内外膜更加完整、光滑,结构更加致密,界线较为清晰明显,补阳还五汤低、高剂量组内外膜仍有一定脱落,弹性纤维排列比较杂乱,变化不明显;药物干预后各组TXNIP、GSDMD、IL-1β、NOX4的mRNA表达均下降(P<0.05);补阳还五汤中剂量组和氢氯噻嗪组TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、IL-18、AngⅡ、MDA的蛋白表达降低(P<0.05),SOD蛋白表达升高(P<0.05)。结论补阳还五汤可通过抑制氧化应激,调节TXNIP/GSDMD信号通路的分子表达,调控血管内皮焦亡,从而发挥保护血管、治疗高血压病的作用。

雷公藤红素通过调控ATF4/caspase-3/GSDME信号通路促进肝癌细胞焦亡

目的探究雷公藤红素(tripterine,TRI)抑制肝癌细胞(hepatocellular carcinoma,HCC)进展的新机制。方法利用不同浓度(0、0.5、2和8μmol·L-1)TRI作用于肝癌细胞,然后利用CCK-8、细胞克隆、Transwell和蛋白免疫印迹等实验方法评估细胞表型和可能机制;再利用siRNA将靶基因GSDME进行干扰,确定GSDME的作用;最后使用移植肿瘤模型验证TRI在体内抑制HCC细胞的生长的机制。结果TRI可抑制HCC细胞增殖、克隆和侵袭,促进细胞焦亡。免疫印迹结果显示,TRI处理后肝细胞癌HepG2或Hepa1-6中GSDME表达均上调,同时cleaved caspase-3和PARP也明显升高。敲除GSDME后可部分逆转TRI诱导的细胞焦亡。同时GSDME敲低后的细胞具有更强的克隆和迁移能力,且与单独的TRI治疗组相比,细胞凋亡率降低。在体内实验中,TRI抑制可HCC肿瘤生长,TRI+siGSDME组小鼠肿瘤生长速度比单独TRI治疗组快。此外,TRI刺激后HepG2和Hepa1-6细胞中p-eIF2a、ATF4均升高。免疫荧光结果显示,TRI刺激后HepG2和Hepa1-6细胞中ATF4阳性细胞数呈剂量依赖性增加。结论TRI抑制肝癌细胞生长和侵袭可能与其调控ATF4/caspase-3/GSDME信号通路促进肝癌细胞焦亡有关。

GSDMD介导的肝细胞焦亡在急性肝衰竭中的致病机制

消皮素D(gasdermin D,GSDMD)是一种广泛表达的蛋白质,可以被肝细胞内的炎性因子激活。一旦被激活,GSDMD的N末端域(GSDMD-N)将形成孔道,导致细胞膜破裂和胞浆泄漏,最终导致细胞死亡。细胞焦亡是GSDMD介导的最具特征的致炎性裂解细胞死亡模式。最近研究发现,GSDMD被激活可扩大炎症反应,诱导肝细胞焦亡,进而加快急性肝衰竭的进展。本文着重探讨了GSDMD介导的肝细胞焦亡在急性肝衰竭中的致病机制及潜在的治疗靶点,以期为寻找有效治疗急性肝衰竭的潜在干预靶点提供新思路。

邻苯二甲酸单丁酯通过Caspase-3/GSDME通路诱导睾丸间质细胞焦亡

目的探讨邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate,MBP)诱导睾丸间质细胞(TM-3细胞)焦亡及其可能的发生机制。方法用浓度为0、2.5、5、10 mmol·L^(-1) MBP(对照组,低剂量组,中剂量组,高剂量组)染毒对数生长期细胞24 h后,光学显微镜观察细胞形态学变化;微量酶标法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的释放率;荧光显微镜检测PI阳性细胞比例;Western blot检测焦亡相关蛋白Caspase-3、GSDME的相对表达水平。将对数生长期的TM-3细胞暴露于浓度梯度(0、2.5、5、10、20μmol·L^(-1))的Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO中24 h,CCK-8法检测细胞活力,确定Ac-DEVD-CHO染毒剂量。Ac-DEVD-CHO作用于细胞验证MBP诱导TM-3细胞焦亡的机制。结果与对照组相比,各染毒组细胞LDH的释放率、PI阳性细胞比例以及Caspase-3和GSDME蛋白的相对表达水平均升高(P均<0.05)。当Ac-DEVD-CHO浓度为5.0μmol·L^(-1)时,细胞存活率为99.17%(P>0.05),并且中剂量+抑制剂组的细胞存活率较中剂量组升高(P<0.01)。确定抑制剂的干预浓度为5.0μmol·L^(-1)。并且中剂量+抑制剂组的LDH的释放率、PI阳性细胞比例以及Caspase-3和GSDME蛋白的相对表达水平较中剂量组下降(P均<0.05)。结论MBP可以通过Caspase-3/GSDME通路诱导睾丸间质细胞焦亡。

LncRNA-CASC2竞争性结合miR-193a-5p调控GSDMD焦亡通路逆转非小细胞肺癌顺铂耐药的分子机制

目的探讨LncRNA-CASC2竞争性结合miR-193a-5p调控GSDMD焦亡通路逆转非小细胞肺癌顺铂耐药的分子机制。方法选用非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549进行研究,建立耐药株A549/DDP,通过CCK8检测细胞对顺铂的敏感性验证耐药细胞株是否成功建立。利用PCR检测CASC2在A549和A549/DDP细胞中的表达情况以及对GSDMD2、miR-193a-5p表达的影响。通过生物信息学软件预测LncRNA-CASC2与miR-193a-5p、miR-193a-5p与GSDMD结合位点,利用荧光素酶报告基因分析CASC2与miR-193a-5p、miR-193a-5p与GSDMD靶向关系,Western blot检测LncRNA-CASC2竞争性结合miR-193a-5p调控GSDMD焦亡通路的蛋白表达变化。结果A549/DDP细胞的半抑制浓度值是A549细胞的10倍以上,表明已成功构建耐药细胞株A549/DDP。A549/DDP中CASC2表达较细胞A549降低(P<0.05)。CASC2 mimics可抑制细胞中miR-193a-5p表达,同时GSDMD表达上调(P<0.05)。CASC2与miR-193a-5p、miR-193a-5p与GSDMD具有明显靶向关系(P<0.05)。结论非小细胞肺癌细胞中LncRNA-CASC2、miR-193a-5p低表达与GSDMD的高表达,与非小细胞肺癌化疗耐药性密切相关,LncRNA-CASC2与miR-193a-5p相互作用调控GSDMD,促进肿瘤细胞耐药。

GSDMD在肿瘤中的研究进展

GSDMD属于gasdermin家族,是细胞焦亡通路当中的关键因子,其与gasdermin家族其他的因子包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME和DFNB59一样都具有相同的双域结构,这种结构诱导了细胞焦亡的发生。细胞焦亡与机体的防御、炎症、自身免疫性疾病和许多其他系统性疾病中均存在着千丝万缕的联系,而GSDMD又作为细胞焦亡的关键触发点与许多疾病的发生都存在联系。本文就GSDMD在肿瘤当中的研究进展作一综述。

FTO、GSDMD在胃癌组织中的表达及其作用机制研究

目的探讨肥胖相关蛋白(FTO)与消皮素D(GSDMD)在胃癌(GC)组织中的表达及其作用机制。方法通过TIMER 2.0数据库分析FTO及GSDMD在GC组织中的差异表达。收集2022年1月至2023年3月广西医科大学第二附属医院手术切取的GC组织及其对应癌旁组织(距离肿瘤边缘3~5 cm)各45例,并收集患者的临床病理资料。采用免疫组织化学染色法检测组织中FTO、GSDMD的表达情况,分析其与患者临床病理特征的关联性。通过转染低表达FTO慢病毒构建低表达FTO的AGS细胞(FTO低表达组),并以转染空载体慢病毒的细胞作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测两组细胞FTO mRNA、GSDMD mRNA的表达水平;采用细胞划痕实验及细胞迁移实验分析两组细胞迁移能力。结果基于TIMER 2.0数据库的分析结果及免疫组织化学染色结果显示,FTO、GSDMD在GC组织中呈高表达(P<0.05)。FTO和GSDMD高表达均与肿瘤侵犯深度、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。细胞实验结果显示,FTO低表达组的GSDMD mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05),划痕愈合率更低,细胞迁移数更少,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论FTO可能通过调控GSDMD表达促进GC细胞转移。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路探讨针灸预防应激性胃溃疡细胞焦亡的作用机制

目的:观察针刺与艾灸对应激性胃溃疡模型大鼠的防治作用及其对模型大鼠胃黏膜NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)细胞焦亡通路的干预作用,探索其作用机制。方法:将SD大鼠随机分为正常组、模型组、预灸组和预针刺组。预灸组和预针刺组大鼠分别予艾灸、针刺中脘、足三里,每穴刺激20 min,连续7 d;正常组、模型组大鼠仅予艾灸支架固定。除正常组外,其余各组大鼠采用无水乙醇与阿司匹林混悬液灌胃制备应激性胃溃疡模型。造模结束后次日,各组大鼠麻醉后取血分离血清,取胃黏膜组织。评估胃黏膜损伤指数(UI),苏木精-伊红(HE)染色法观察胃黏膜组织的病理形态变化,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-18水平,蛋白质免疫印迹(Western blot)法分析胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达。结果:模型组大鼠UI值明显高于正常组(P<0.01),胃黏膜组织明显损伤,存在出血灶,病理显示大量红细胞渗出;预灸组和预针刺组大鼠UI值均明显低于模型组(P<0.01),其中预灸组UI值明显低于预针刺组(P<0.05);预灸组和预针刺组胃黏膜组织表面只有少量出血灶,病理显示胃黏膜大体完整,有少量红细胞渗出,其中预灸组胃黏膜病变程度更轻。模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平均明显高于正常组(P<0.01);预灸组和预针刺组上述指标水平均明显低于模型组(P<0.05,P<0.01),其中预灸组上述指标水平均明显低于预针刺组(P<0.05,P<0.01)。模型组大鼠胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达水平均显著高于正常组(P<0.05);预灸组和预针刺组上述蛋白表达水平均明显低于模型组(P<0.05),其中预灸组Caspase-1蛋白表达水平明显低于预针刺组(P<0.05)。结论:针刺与艾灸均可以预防应激性胃溃疡胃黏膜损伤,其可能通过调控胃黏膜组织中NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路蛋白表达水平,缓解胃黏膜炎症反应,其中艾灸预处理对炎症因子的改善更具优势。

小鼠GSDME对肿瘤进展的抑制作用及其机制

目的 探究GSDME对小鼠肿瘤进展的影响及机制。方法 利用蛋白质免疫印迹检测蛋白表达;利用野生型和GSDME敲除小鼠构建肿瘤模型并监测肿瘤进展;利用CRISPR-Cas9技术敲除MC38细胞的GSDME并构建肿瘤模型。利用体外诱导骨髓细胞分化成为巨噬细胞和树突状细胞,并分别进行尾静脉回输观察肿瘤生长;利用多通道流式细胞技术检测肿瘤中免疫细胞的浸润、CD8^(+)T细胞的功能分子、肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞的Cleaved Caspase-3及表型分子。结果 GSDME敲除促进肿瘤进展,减少肿瘤内CD8^(+)T细胞数量,减少IFN-γ和Perforin在CD8^(+)T细胞的表达。GSDME主要表达在巨噬和树突状细胞,分别回输GSDME敲除的巨噬和树突状细胞不显著影响肿瘤进展。GSDME敲除小鼠肿瘤内Cleaved Caspase-3阳性巨噬和树突状细胞减少,且Cleaved Caspase-3阳性巨噬细胞表达更多iNOS和MHCII,Cleaved Caspase-3阳性树突状细胞表达更多CD80和CD86。结论 GSDME增加具有促进CD8^(+)T细胞功能的Cleaved Caspase-3阳性巨噬和树突状细胞,进而抑制肿瘤进展。

参附注射液对NLRP3/Caspase-1/GSDMD介导的J774A.1细胞焦亡的影响

目的观察参附注射液对NLRP3/Caspase-1/GSDMD介导的J774A.1细胞焦亡的影响并探讨其机制。方法采用MTT法确定低、中及高剂量参附注射液组药物浓度分别为2.5、5、10μL/mL。将J774A.1细胞分为5组,每组6孔。空白组在细胞接种后,常规培养细胞;模型组细胞在100 ng/mL LPS提前处理4 h之后加入10μmol/L Nigericin处理2 h;低、中和高参附注射液组细胞在模型组的基础上加入上述相应浓度的参附注射液进行共刺激。倒置显微镜观察各组细胞形态改变;LDH释放法检测各组细胞活性;Western blotting检测细胞及上清液中Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD及GSDMD-N蛋白水平;ELISA检测细胞培养上清中白细胞介素-1β(IL-1β)水平。结果在模型组细胞中观察到膨胀球形改变及胞膜破裂,向胞外释放的LDH明显增多(P<0.05),经参附注射液干预后形态改变有减轻,LDH释放显著减少(P<0.05);Western blotting结果显示,模型组Caspase-1及GSDMD-N蛋白水平显著升高(P<0.05),经参附注射液干预后,上述蛋白水平明显下降(P<0.05);ELISA测得的细胞培养上清IL-1β水平,在模型组中亦明显升高(P<0.05),而在各参附注射液组中均有显著下降(P<0.05)。结论参附注射液能抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD介导的J774A.1细胞焦亡改变,机制可能与其抑制Pro-Caspase-1与GSDMD的活化过程相关。

补肾止颤方调控miR-296-5p/GSDMD通路抑制帕金森病大鼠神经元焦亡机制研究

目的从焦亡角度探讨补肾止颤方保护帕金森病(Parkinson's disease,PD)大鼠中脑黑质区神经元的作用以及可能机制。方法将60只雄性SD大鼠随机分为正常组,模型组,补肾止颤方低(15 g·kg-1)、中(30 g·kg-1)、高(60 g·kg-1)剂量组,美多芭组(0.2 g·kg-1)。除正常组外,余各组予背部皮下注射蛋白酶体抑制因子I(proteasome inhibitors I,PSI)溶液构建慢性PD模型。模型组与正常组予等体积生理盐水灌胃,余各组予对应药物剂量灌胃,连续干预3周。采用行为学观察爬杆实验评估各组大鼠行为学改变,予透射电镜观察大鼠中脑黑质区神经元细胞结构变化;实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative PCR,RT-PCR)检测大鼠中脑黑质区miR-296-5P及Gasdermin D(GSDMD)蛋白、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)蛋白表达;双荧光素酶报告基因技术测定miR-296-5p与GSDMD上的靶向调控作用。结果与正常组比较,余各组大鼠出现自主活动减少、全身不自主震颤、行走迟缓等症状,悬挂实验评分下降(P<0.05);电镜下可见神经元细胞呈不同程度的水肿,部分细胞膜结构模糊,细胞核呈不规则形,细胞中α-syn、Caspase-1、IL-1β、GSDMD mRNA表达明显升高(P<0.05),TH及miR-296-5p表达水平明显下降(P<0.05)。与模型组比较,补肾止颤方低、中、高剂量组大鼠全身不自主震颤、行走迟缓等症状改善,悬挂实验评分升高(P<0.05),细胞水肿减轻,细胞中α-syn、Caspase-1、IL-1β、GSDMD mRNA表达呈不同程度下降(P<0.05),TH及miR-296-5p表达水平升高(P<0.05),以补肾止颤方高剂量组改变显著;荧光素酶报告显示miR-296-5p可靶向调控GSDMD的表达。结论补肾止颤方能改善PD大鼠的运动协调能力及受损的神经元细胞,其机制可能与调控miR-296-5p/GSDMD通路,下调Caspase-1蛋白及炎性因子水平,减轻神经炎症反应,从而抑制PD大鼠神经元细胞焦亡有关。

参芪温肺方减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺气虚证:基于调节NLRP3/GSDMD细胞焦亡通路

目的探讨参芪温肺方(SQWF)对香烟烟雾联合脂多糖(LPS)诱导的慢性阻塞性肺疾病(COPD)肺气虚证模型大鼠NLRP3/GSDMD信号通路的影响。方法将SD大鼠随机分为空白组(10 mL/kg,8只)、模型组(10 mL/kg,8只)、SQWF低(2.835 g/kg,8只)、中(5.67 g/kg,8只)、高(11.34 g/kg,8只)剂量组、玉屏风组(1.35 g/kg,8只),建立COPD肺气虚证大鼠模型。观察大鼠体质量、抓力、肺功能、肺组织病理改变、检测外周血中炎性细胞和BALF中炎症因子水平;Q-PCR及免疫组化法检测肺组织NLRP3/GSDMD信号通路相关分子的表达。结果与空白组相比,模型组大鼠体质量、抓力及肺功能均降低(P<0.01)、肺组织病理损伤较重;外周血中WBC、NEU%、MON%水平升高(P<0.01),LYM%降低(P<0.01),BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18含量均升高(P<0.01);肺组织中NLRP3、ASC、GSDMD、IL-1β、mRNA及其蛋白表达水平升高(P<0.01),与模型组相比,SQWF各组及玉屏风组的体质量、抓力、肺功能及肺组织病理明显改善(P<0.05);WBC、NEU%及MON%水平降低(P<0.01),LYM%升高(P<0.01),TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18含量均降低(P<0.01);肺组织NLRP3、ASC、GSDMD及IL-1β的mRNA和蛋白阳性表达水平下调(P<0.05),而Caspase-1和IL-18的mRNA水平下调不显著(P>0.05),且SQWF呈浓度依赖性。结论参芪温肺方可能通过调节NLRP3/GSDMD通路抑制肺组织细胞焦亡,缓解COPD肺气虚证大鼠炎症反应,减轻肺组织炎性损伤。

NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡信号轴在六味地黄丸防治大鼠骨质疏松症中的作用

目的基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号轴探讨六味地黄丸抗骨质疏松的作用。方法48只健康SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、六味地黄丸组以及阿仑膦酸钠组,每组12只。除假手术组外,其余各组经双侧卵巢切除造模后,六味地黄丸组予以六味地黄丸157.5 mg/(kg·d)灌胃,阿仑膦酸钠组予以阿仑膦酸钠片7.35 mg/(kg·d)灌胃,假手术组与模型组给予等量生理盐水灌胃,干预12周后取得大鼠骨组织以备分析。采用骨组织转录组学(RNA-Sequence)对模型组和六味地黄丸组进行测序分析;分析大鼠骨矿含量、弹性模量、股骨刚度、右侧股骨和腰椎骨密度(bone mineral density,BMD)水平变化;采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)等水平;采用实时荧光定量PCR法(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测骨组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、Caspase-1、GSDMD(gasdermin-D)mRNA表达水平;采用Western blot法检测骨组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平。结果RNA-Sequence测序分析与KEGG分析表明,六味地黄丸组富集潜在靶基因最多的通路有细胞焦亡通路和炎症通路;热图差异表达基因排在前6位的为:NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-6、IL-1β、TNF-α。与模型组比较,六味地黄丸组大鼠骨矿含量和弹性模量升高(P<0.05),股骨刚度、右侧股骨和腰椎BMD均明显升高(P<0.01);六味地黄丸组大鼠血清Caspase-1、IL-1β、TNF-α含量较模型组均明显降低(P<0.01);六味地黄丸组NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表达量较模型组均降低(P<0.05),NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路相关蛋白表达量亦降低(P<0.05)。结论六味地黄丸能够通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号轴降低炎症水平,以抗骨质疏松。

FBW7基因通过GSDME介导的焦亡增强紫杉醇对胰腺癌的抗肿瘤作用研究

背景与目的:胰腺癌是恶性程度极高的肿瘤,多数患者在就诊时已处于晚期,全身化疗是重要的治疗手段,但是化疗耐药给临床治疗带来很多困扰。紫杉醇作为常用的化疗药物可以诱导肿瘤细胞发生凋亡,含F-框WD重复域蛋白7(F-box and WD repeat domain containing 7,FBW7)基因是一种抑癌基因,该基因的功能丧失会导致肿瘤发生、发展。研究表明,FBW7基因具有促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤增殖的作用。此外,该基因还被证实可以促进凋亡和通过铁死亡方式增加化疗药物的效果。焦亡是一种由焦孔素(gasdermin,GSDM)蛋白介导的细胞程序性死亡模式,这种细胞死亡往往还伴有炎症反应。本研究旨在探讨FBW7基因是否可以通过焦亡促进紫杉醇发挥抗肿瘤作用。方法:采用慢病毒转染构建FBW7过表达的PANC-1细胞株,采用免疫组织化学法检测临床标本中FBW7和GSDME基因表达的相关性,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测mRNA表达和蛋白质水平。光镜下观察细胞经紫杉醇处理后的形态变化,采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测紫杉醇对细胞活力的影响,采用流式细胞术、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验检测紫杉醇对肿瘤细胞的影响。Western blot检测经紫杉醇处理后肿瘤细胞中caspase-3和GSDME的活化情况。结果:RTFQPCR和Western blot检测结果表明,FBW7基因过表达可增加GSDME的表达。免疫组织化学检测结果表明,在体内FBW7和GSDME基因表达呈正相关。流式细胞术和LDH释放实验检测结果显示,FBW7过表达的胰腺癌细胞系PANC-1系经过紫杉醇药物刺激后,细胞死亡的水平较空载体(empty vector,EV)组显著增加。光镜下可观察到具有焦亡表现的FBW7过表达的PANC-1细胞株显著多于EV组细胞。CCK-8实验结果显示,FBW7过表达的细胞株在紫杉醇处理后细胞活性显著低于EV组细胞。Western blot检测结果显示,紫杉醇处理胰腺癌细胞系PANC-1后,FBW7过表达细胞株的活化caspase-3(activecaspase-3)和GSDME-NT蛋白水平增加,证明其有更加明显的活化。FBW7基因可以通过caspase-3/GSDME信号转导通路诱导的细胞焦亡增加PANC-1细胞对紫杉醇的敏感性。结论:FBW7可以通过上调GSDME的表达,增加胰腺癌细胞对紫杉醇诱导的细胞焦亡从而增加其对紫杉醇的敏感性,这种作用可能是通过caspase-3/GSDME信号转导通路实现的。

延胡索总生物碱对慢性癫痫大鼠皮层NLRP3/caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡的影响

目的:研究延胡索总生物碱(TAC)对戊四氮(PTZ)所诱导的慢性癫痫大鼠的治疗作用,探讨其对大脑皮层核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/caspase-1/消皮素D(GSDMD)介导的细胞焦亡的影响及可能机制。方法:清洁级雄性SD大鼠30只,随机抽取6只大鼠作为正常组,其余大鼠采用PTZ(35 mg/kg)腹腔连续注射28 d复制慢性癫痫模型。将造模成功的18只大鼠随机分为模型组、低剂量TAC组和高剂量TAC组,每组6只。低、高剂量TAC组大鼠分别灌胃给予7和14 mg/kg的TAC,连续给药14 d,正常组和模型组大鼠灌胃给予等体积生理盐水。观察记录大鼠全面强直阵挛发作(GTCS)和极小阵挛发作(MCS)的潜伏期;采用HE染色观察颞叶皮层的病理学变化;TUNEL法检测神经细胞凋亡;免疫组化和Western blot法检测皮层组织核因子κB(NF-κB)、NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白表达;免疫组化检测脑组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素18(IL-18)和IL-1β蛋白表达;RT-qPCR检测各组NLRP3、caspase-1和GSDMD的mRNA表达。结果:与正常组相比较,模型组大鼠GTCS和MCS的潜伏期显著缩短(P<0.01);模型组大鼠皮层神经细胞凋亡数量显著增加,皮层组织中TNF-α、IL-18和IL-1β蛋白表达均显著增加,NF-κB、NLRP3、caspase-1 p20和GSDMD N端片段(GSDMD-N)的mRNA及蛋白表达也显著增加(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,各剂量TAC组大鼠GTCS和MCS的潜伏期显著延长,皮层神经细胞凋亡数量显著减少,皮层组织中TNF-α、IL-18和IL-1β蛋白表达均显著减少,NF-κB、NLRP3、caspase-1 p20和GSDMD的mRNA及蛋白表达也均显著减少(P<0.01)。结论:TAC可能通过NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路,减少炎症因子分泌,抑制神经细胞焦亡,从而对PTZ诱导的慢性癫痫大鼠起到治疗作用。

新补骨脂异黄酮通过caspase-3/GSDME通路诱导肝细胞癌Huh-7细胞焦亡

目的:探讨新补骨脂异黄酮(NBIF)对肝细胞癌(HCC)Huh-7细胞焦亡的影响及其分子机制。方法:体外培养Huh-7细胞,用CCK-8法检测不同浓度的NBIF处理48 h时对细胞存活率的影响,光学显微镜下观察NBIF处理后Huh-7细胞的形态变化,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞的LDH释放量,WB实验检测细胞中GSDME、caspase-3的蛋白水平变化。采用si RNA干扰Huh-7细胞中caspase-3、GSDME表达后,CCK-8法检测NBIF处理对细胞存活率的影响,WB实验检测GSDME蛋白表达水平,观察NBIF处理对细胞形态的影响,并检测细胞LDH释放量。结果:60μmol/L以上的NBIF均能显著抑制Huh-7细胞的增殖(均P<0.01),光学显微镜下观察到NBIF处理后的细胞出现肿胀、吐泡现象,且LDH释放增加(P<0.01);WB实验结果表明,NBIF能够激活caspase-3蛋白并切割GSDME蛋白,增加GSDME-N的表达(均P<0.01)。干扰caspase-3、GSDME表达后,NBIF对细胞的抑制作用减弱(均P<0.01),GSDME-N蛋白表达受到抑制(P<0.01),显微镜下细胞肿胀、吐泡现象几乎消失,LDH释放明显减少(P<0.05)。结论:NBIF能够通过caspase-3/GSDME途径诱导Huh-7细胞发生焦亡,从而抑制HCC细胞的增殖,为HCC的治疗提供一种新思路。

芦荟大黄素通过激活Caspase-3/GSDME焦亡通路发挥抗胶质瘤作用

目的 探讨芦荟大黄素(AE)抗脑胶质母细胞瘤(GBM)的作用及机制。方法 梯度浓度AE处理体外培养的GBM细胞,MTT实验检查GBM细胞活力,倒置显微镜及LDH释放实验检测AE对GBM细胞的焦亡诱导作用;Western blot实验检测AE对Caspase-3、GSDME蛋白的活化作用,qPCR检测AE对GBM细胞GSDME在m RNA水平的调控作用;DCFH-DA标识GBM细胞活性氧,荧光显微镜及流式细胞术检测AE处理的GBM细胞活性氧产生水平,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位。结果 与对照组相比,AE能显著降低GBM细胞活性(P <0.05),诱导GBM细胞出现焦亡特异性外观和LDH释放,剪切活化Caspase-3和GSDME蛋白,在mRNA水平升高GSDME的表达,诱导GBM细胞活性氧产生及线粒体膜电位降低。结论 芦荟大黄素通过激活Caspase-3/GSDME焦亡通路诱导GBM焦亡发挥抗胶质瘤作用。

焦亡核心分子GSDME作为与预后和免疫相关的肝癌新型生物标志物

目的:GSDME (DFNA5)是焦亡执行蛋白gasdermin家族基因成员之一。大量研究表明GSDME表达与肿瘤发生发展之间存在很强的相关性。然而,GSDME在肝癌中的表达和生物学功能仍不清楚。方法:我们使用TIMER2.0数据库探讨了泛癌中GSDME的mRNA表达情况。还使用GEPIA和UALCAN数据库来确定HCC中GSDME的mRNA表达和蛋白表达。UALCAN用于分析GSDME和肝癌亚组分级之间的关系。还使用Kaplan-Meier研究了GSDME的表达与肝癌预后的相关性。使用TIMER2.0数据库分析了GSDME表达与肝癌微环境中免疫细胞浸润和免疫检查点之间的相关性。免疫组织化学技术(HPA)用于探索GSDME蛋白在HCC和正常肝组织中的表达情况。结果:与正常组织相比,GSDME在肝癌中表达上调。肝癌中高GSDME表达预示有较高的组织分级、肿瘤分期和较多的淋巴结转移,同时高GSDME表达预示总生存期和疾病特异性生存期较差。GSDME的表达与肝癌中B细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和NK细胞的浸润水平显着相关。同时GSDME的表达与免疫治疗检查点PD-1、CTLA4和PD-L1的表达显著相关。结论:我们的研究结果表明GSDME在HCC中过表达,并且GSDME表达与HCC中的免疫浸润和预后显着相关。因此,GSDME可作为肝癌免疫治疗和预后的生物标志物。

艾灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路的影响

目的:观察艾灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜细胞焦亡NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路的影响。方法:将30只健康SPF级SD大鼠雌雄各半,分为正常组、模型组和艾灸预处理组。选取足三里(双侧)和中脘穴进行艾灸预处理7 d,再用无水乙醇灌胃法进行造模,观察胃黏膜组织形态,评估UI指数,ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)3种细胞因子的表达量;Western blot检测大鼠胃组织炎性小体核苷酸寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)及胱天蛋白酶-1(Caspase-1)、消皮素(GSDMD)的表达水平。结果:艾灸预处理后,机体在应对致病因素刺激时可抑制IL-1β、IL-18及TNF-α的分泌,对比正常组和模型组均有明显下降(P<0.01),NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白的表达量均低于正常组和模型组(P<0.01)。结论:艾灸预处理通过NLRP3/Caspase-1/GSDMD经典通路途径抑制细胞焦亡,降低炎症发生的程度,达到保护胃黏膜的作用。