甘草酸通过抑制GSDMD介导的非典型细胞焦亡改善铜绿假单胞菌诱导角膜炎症和损伤

目的:探究甘草酸通过抑制Gasdermin-D(GSDMD)介导的非典型细胞焦亡改善铜绿假单胞菌诱导的炎症和角膜损伤。方法:制备铜绿假单胞菌角膜炎大鼠模型,将大鼠随机分为对照组、PA组和GLY+PA组。比较各组角膜炎症指数;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清炎症因子;苏木素-伊红(HE)染色检测角膜组织病理学变化;免疫荧光检测角膜组织中半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶11(caspase-11)和GSDMD阳性表达;分别用蛋白质印迹法和qRT-PCR检测检测角膜组织中半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶4(caspase-4)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶5(caspase-5)、caspase-11、GSDMD蛋白和mRNA表达。结果:PA组大鼠角膜炎症指数和血清中白介素1β(IL-1β)、白介素18(IL-18)水平、炎症细胞密度、caspase-11和GSDMD阳性表达面积百分比及角膜组织中caspase-4、caspase-5、caspase-11、GSDMD蛋白和mRNA表达均明显高于对照组;和PA组相比,GLY+PA组大鼠角膜炎症指数和和血清中IL-1β、IL-18水平、炎症细胞密度、caspase-11和GSDMD阳性表达面积百分比及角膜组织中caspase-4、caspase-5、caspase-11、GSDMD蛋白和mRNA表达均明显降低。结论:甘草酸可减轻铜绿假单胞菌角膜炎大鼠角膜炎症反应和组织损伤,其作用机制可能和抑制GSDMD介导的非典型细胞焦亡途径激活有关。

猪流行性腹泻病毒非结构蛋白NSP15抑制细胞焦亡的分子机制研究

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)及其NSP15蛋白对细胞焦亡的影响及初步的分子作用机制,本研究将表达pGSDMD-p30的质粒转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞),24 h后将PEDV感染该细胞,于感染后12 h和24 h分别收集细胞上清液和细胞,采用LDH试剂盒测定各时间点细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放比例;采用qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,各时间点,转染表达pGSDMD-p30质粒的IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均极显著升高,表明细胞发生焦亡,且与转染p GSDMD-p30质粒的细胞相比,PEDV感染的细胞中LDH的释放比例及GSDMD mRNA的转录水平均极显著降低。将表达pGSDMD-p30的质粒分别与不同剂量的PEDV-NSP15质粒共转染HEK293T细胞(pGSDMD-p30+NSP15组);将表达Caspase-1、pGSDMD和表达NSP15的质粒分别共转染HEK293T和IPEC-J2细胞(Caspase-1+pGSDMD+NSP15组)。上述细胞于24 h后均测定各组细胞上清液中LDH的释放比例。结果显示,与pGSDMD-p30组(共转染表达pGSDMD-p30与空载体的细胞)相比,pGSDMD-p30+NSP15组HEK293T细胞及IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均显著降低;与Caspase-1+pGSDMD对照组细胞相比,Caspase-1+pGSDMD+NSP15组细胞中LDH的释放比例极显著降低。上述结果表明,NSP15在不同细胞中均可以抑制GSDMD-p30及GSDMD+Caspase-1两种方式引起的细胞焦亡,提示PEDV可能通过NSP15抑制细胞的焦亡。将自噬抑制剂3-MA和蛋白酶体途径抑制剂MG132分别加入不同剂量的NSP15质粒与MYC-pGSDMD质粒共转染的HEK293T细胞中,6 h后采用western blot检测细胞中GSDMD的表达水平;将上述质粒共转染HEK293T细胞,24 h后通过qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,随着NSP15转染剂量的增加,细胞中GSDMD的表达水平逐渐减少,加入3-MA和MG132并不影响GSDMD的表达水平;相比于共转染空载体和NSP15质粒的对照组,MYC-pGSDMD+NSP15组细胞中GSDMD mRNA的转录水平极显著降低。上述结果表明,PEDV NSP15降解GSDMD的过程不是通过自噬和蛋白酶体途径实现的。将4个核酸内切酶活性位点突变的NSP15质粒分别与pGSDMD-p30或pGSDMD质粒共转染HEK293T细胞,24 h后采用LDH试剂盒测定各组细胞上清中LDH的释放比例;采用western blot检测各组细胞中GSDMD的表达水平。结果显示,与p30组相比,H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞上清中LDH的释放比例均无显著变化,而D^(265)突变组细胞上清中LDH的释放比例极显著降低;H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞中GSDMD的表达水平与阴性对照组细胞中GSDMD的表达水平相当,而D^(265)突变组细胞中GSDMD的表达水平明显减少。上述结果表明,PEDV通过其NSP15蛋白抑制各种细胞的细胞焦亡,且本研究首次证明该蛋白通过其核酸内切酶活性位点H^(226)、H^(241)和K^(282)降解GSDMD并抑制细胞焦亡,为PED的治疗和开发抗PED的药物提供参考。

非经典细胞焦亡体外模型的构建

旨在深入研究非经典细胞焦亡的激活机制,本研究在体外构建非经典细胞焦亡模型,利用PCR方法扩增人源目的基因Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p30,使用无缝克隆的方法连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC,利用VigoFect试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染的方法构建非经典的细胞焦亡模型,分别检测细胞上清中LDH的释放、GSDMD有无被切割为有活性的N端p30片段和荧光观察PI染色情况来确定非经典细胞焦亡模型是否构建成功。结果显示:pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL重组质粒均成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均成功表达,质粒共转染后LDH分泌显著升高,Caspase-4将GSDMD全长片段切割为有活性N端GSDMD-p30片段,荧光显微镜观察到明显的PI染色,表明非经典细胞焦亡模型体外构建成功。非经典细胞焦亡模型在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。

电针对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞焦亡非经典途径的调控作用研究

目的:观察电针对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)肝细胞焦亡非经典途径的影响及其作用机制。方法:将60只雄性SD大鼠随机分为普通饮食组(n=15)和高脂造模组(n=45),高脂造模组以定制高脂饲料喂养8周建立NAFLD模型。从造模成功的大鼠中选取30只随机分为模型组(n=10)、电针组(n=10)和非穴浅刺组(n=10),另从普通饮食组中随机选取10只大鼠作为对照组。电针组大鼠于双侧“丰隆”“肝俞”穴行电针干预,予疏密波,频率4 Hz/20 Hz,电流强度3 mA;非穴浅刺组大鼠于双侧“丰隆”“肝俞”穴旁5 mm处浅刺,电针刺激参数同电针组。两组干预均每日1次,每次20 min,每周5 d,连续干预4周。干预后,采用油红“O”染色法观察各组大鼠肝脏形态;ELISA法检测各组大鼠血清脂多糖(LPS)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;Western blot法检测各组大鼠肝脏组织消皮素D(GSDMD)、GSDMD末端氨基结构域(GSDMD-N)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-11、IL-1β、IL-18及TNF-α蛋白表达;实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肝脏组织GSDMD、Caspase-11、IL-1β、IL-18及TNF-αmRNA表达。结果:模型组大鼠肝细胞胞质中可见大小不等的空泡,脂滴呈片状堆积;与模型组比较,电针组及非穴浅刺组大鼠肝细胞脂滴减少,肝脏脂肪变性程度降低。与对照组比较,模型组大鼠血清LPS、IL-1β、IL-18、TNF-α含量升高(P<0.01);肝脏组织GSDMD、Caspase-11、IL-1β、IL-18、TNF-α蛋白和mRNA表达升高(P<0.01),GSDMD-N蛋白表达升高(P<0.01)。与模型组比较,电针组及非穴浅刺组大鼠血清LPS、IL-1β、IL-18、TNF-α含量降低(P<0.01),肝脏组织GSDMD、IL-1β、IL-18、TNF-α蛋白及mRNA表达降低(P<0.01),肝脏组织GSDMD-N蛋白表达及Caspase-11 mRNA表达降低(P<0.01);电针组大鼠肝脏组织Caspase-11蛋白表达降低(P<0.01)。与非穴浅刺组比较,电针组大鼠血清LPS、IL-1β、IL-18、TNF-α含量降低(P<0.01);肝脏组织GSDMD、Caspase-11、IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达降低(P<0.01),GSDMD-N蛋白及TNF-αmRNA表达降低(P<0.01)。结论:电针干预可抑制NAFLD大鼠肝细胞焦亡,其作用机制可能与降低血清LPS含量,下调细胞焦亡非经典途径相关因子GSDMD、GSDMD-N、Caspase-11、IL-1β、IL-18、TNF-α表达相关。