电针预处理对急性肺损伤大鼠炎症反应及GSDMD-N蛋白表达的影响

目的:观察电针预处理对脂多糖(LPS)诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)炎症反应以及对肺组织内GSDMD-N蛋白表达的影响。方法:将24只大鼠随机分为三组,分别为空白组、ALI组和电针预处理组。电针预处理组在造模前进行电针预处理,穴位选择双侧“尺泽”“足三里”穴,电针波形选择疏密波(疏波频率3 Hz,密波频率15 Hz),刺激强度以局部肌肉轻微收缩为度(约1.0 mA),30 min/次,干预5 d后,电针预处理组尾静脉注射LPS制作ALI模型,ALI组正常喂养5 d后造模,空白组仅正常喂养、不作其他处理。造模6 h后处死动物,取材送检:苏木精-伊红(HE)染色法评估肺组织损伤程度;酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-18(IL-18)水平;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(WB)分别检测GSDMD-N mRNA和蛋白表达。结果:与空白组相比,ALI组病理结果显示肺组织结构明显受损,肺损伤评分增高(P<0.01);血清IL-6、IL-18含量升高(P<0.05,P<0.01);GSDMD-N mRNA表达及蛋白相对表达量明显增高(P<0.01)。与ALI组比较,电针预处理组肺组织损伤程度明显降低,损伤评分减小(P<0.01);血清IL-6表达有所下降,但差异无统计学意义(P>0.05),血清IL-18含量减少(P<0.05);GSDMD-N mRNA表达及蛋白相对表达量明显降低(P<0.01,P<0.05)。结论:电针预处理组可以改善ALI大鼠炎症反应,其机制可能与抑制GSDMD-N蛋白表达有关。

GSDMD-N和p-MLKL蛋白在类风湿关节炎滑膜组织中上调

目的探索类风湿关节炎(RA)患者膝关节滑膜组织中细胞焦亡标志性蛋白GSDMD-N和程序性坏死标志性蛋白p-MLKL的表达水平和意义。方法记录入组患者临床资料,包括性别、年龄、红细胞沉降率(ESR)和超敏C反应蛋白(hsCRP)。对RA和骨关节炎(OA)滑膜HE染色,用Krenn评分评估病理滑膜炎程度。提取RA和OA关节滑膜蛋白,利用Western blot检测细胞焦亡和程序性坏死相关蛋白的表达水平,并分析GSDMD-N、p-MLKL与ESR、CRP水平以及病理性滑膜炎的相关性。结果与OA相比,RA关节滑膜中GSDMD-N和p-MLKL的表达水平显著升高(P<0.05),且与ESR和Krenn评分呈正相关(P<0.05),GSDMD-N与CRP水平亦正相关(P<0.05)。结论RA关节滑膜中细胞焦亡和程序性坏死与疾病活动程度和滑膜炎性水平呈正相关,可能参与RA滑膜炎的进程,有望成为RA治疗的潜在靶点。

银屑病患者血清IL-1β和IL-18水平及皮损GSDMD、GSDMD-N表达检测和意义

为检测银屑病患者血清白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)及皮损GSDMD(gasdermin D)、GSDMD-N的表达水平,初步探讨焦亡信号通路在银屑病发病机制中的作用。选取2020年4月至2021年1月期间在江苏省苏北人民医院皮肤科就诊,符合寻常型银屑病诊断的患者血清20例,皮损10例,设置为寻常型银屑病组(PSO组),另选择体检中心健康者血清20例,整形外科健康求美者皮肤组织10例,设置为健康对照组(CON组)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-1β、IL-18含量;实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测血清IL-1βmRNA含量;Western blot法检测皮肤组织中GSDMD、GSDMD-N端蛋白表达情况,分析IL-1β和IL-18及GSDMD、GSDMD-N表达水平与银屑病的相关性。结果表明:(1)PSO组血清中IL-18[226.59(199.91~412.56)pg·mL^(-1)]较CON组[73.89(62.53~86.76)pg·mL^(-1)]明显升高(P<0.0001),PSO组血清中IL-1β[(58.20±10.51)pg·mL^(-1)]较CON组[(12.33±1.79)pg·mL^(-1)]明显升高(P<0.0001);(2)PSO组患者血清中IL-1βmRNA表达水平明显高于CON组(P<0.0001);(3)与CON组相比,PSO组患者皮损中GSDMD蛋白表达水平升高(P<0.01),且PSO组患者皮损中GSDMD-N端蛋白表达水平也较CON组升高(P<0.0001)。综上所述,寻常型银屑病患者血清IL-1β、IL-18水平升高,焦亡信号通路执行蛋白GSDMD、GSDMD-N在寻常型银屑病患者皮损中表达升高,提示焦亡相关细胞因子在银屑病发病机制中可能发挥一定的作用。

海马区GSDMD-N介导的小胶质细胞焦亡在大鼠心肺复苏脑损伤模型中的研究

目的 探索大鼠心肺复苏(CPR)脑损伤后海马区小胶质细胞的激活和焦亡情况。方法 建立CPR脑损伤模型,将30只雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)和CPR脑损伤组(CPR组),每组15只。采用旷场试验和Morris水迷宫实验分析大鼠的行为变化,确定CPR后脑损伤对负性情绪和认知功能的影响;通过免疫荧光染色技术、流式细胞术和Western blotting观察海马区小胶质细胞的激活、焦亡及相关蛋白的表达情况。结果与Sham组相比,在旷场和Morris水迷宫实验中,CPR组大鼠出现焦虑、抑郁情绪和认知功能障碍(P<0.05);Western blotting结果显示,CPR组大鼠海马组织中的焦亡相关蛋白表达增多(P<0.05);免疫荧光和流式细胞术结果显示,CPR组大鼠海马区小胶质细胞被大量激活,焦亡效应蛋白GSDMD-N表达上调且与激活的小胶质细胞实现了共定位。结论 CPR脑损伤后,海马区GSDMD-N将介导小胶质细胞的焦亡。

六味地黄丸含药血清通过Caspase-1/GSDMD-N通路对Aβ_(1-42)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的影响

目的通过对β-淀粉样蛋白1-42(Aβ_(1-42))诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)损伤模型的研究,以Caspase-1/GSDMD-N为切入点,探讨六味地黄丸含药血清对SH-SY5Y细胞焦亡的影响。方法以终浓度为20μmol·L^(-1)Aβ_(1-42)诱导SH-SY5Y细胞建立细胞损伤模型。实验分为正常对照组、模型组和六味地黄丸含药血清组。采用台盼蓝染色法观察各组细胞形态并计算细胞成活率;采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液中的白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素18(IL-18)的含量。采用蛋白质印迹法检测细胞中Caspase-1和GSDMD-N的蛋白表达。结果与正常对照组相比,模型组细胞成活率显著降低(P<0.01),上清液中IL-1β和IL-18的含量显著增多(P<0.01),Caspase-1和GSDMD-N的蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组相比,含药血清组细胞成活率显著增高(P<0.01),上清液中IL-1β和IL-18的含量显著减少(P<0.01),Caspase-1和GSDMD-N的蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论六味地黄丸含药血清可通过调节Caspase-1/GSDMD-N通路抑制细胞免疫炎性反应,进而抑制细胞焦亡,从而对损伤的SH-SY5Y细胞有保护作用。

血红素激活含pyrin结构域NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性体诱导肾小管上皮细胞焦亡

目的研究血红素是否通过活化肾小管上皮细胞含pyrin结构域NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性体引起焦亡而损伤肾脏功能。方法使用血红素处理人肾小管上皮HK-2细胞,通过扫描电镜观察细胞膜上是否有穿孔,免疫荧光染色检测焦亡执行蛋白消皮素D氨基端蛋白(GSDMD-N)的形成情况,明确血红素是否引起人肾小管上皮HK-2细胞焦亡。通过Western blot法检测NLRP3炎性体相关蛋白分子NLRP3、含胱天蛋白酶募集结构域凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶l前体(pro-caspase-1)和剪切体(caspase-1 p20)、白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)和IL-1β等确定血红素是否引起人肾小管上皮HK-2细胞中NLRP3炎性体的活化;通过异体输血构建小鼠溶血模型在动物水平进一步验证溶血释放的血红素是否活化NLRP3炎性体而导致肾损伤。采集静脉血进行血涂片进行Wright-Giemsa染色光镜观察,分光光度计比色法检测游离血红蛋白;全自动生化分析仪检测血清尿素氮以及HE染色观察肾组织病变情况确定溶血模型建立是否成功;分离提取溶血小鼠肾小管上皮细胞,Western blot法检测NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、pro-IL-1β、IL-1β、GSDMD-N蛋白表达情况明确溶血模型中NLRP3炎性体的活化情况以及焦亡执行蛋白的表达。结果血红素造成肾小管上皮HK-2细胞损伤,细胞膜上出现小孔,焦亡执行蛋白GSDMD-N表达增高,HK-2细胞中NLRP3炎性体相关蛋白caspase-1 p20、IL-1β表达上调;溶血模型小鼠的肾脏功能受损,小鼠肾小管上皮细胞中NLRP3炎性体相关蛋白caspase-1 p20、IL-1β、GSDMD-N表达上调。结论血红素活化肾小管上皮细胞的NLRP3炎性体,诱导焦亡,进而导致肾功能损伤。

血清半胱氨酸蛋白酶-1、Gasdermin家族蛋白D、Gasdermin家族蛋白D-N端在银屑病患者血清及皮损中的表达和意义

目的检测寻常型银屑病患者血清半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)及皮损Caspase-1、Gasdermin家族蛋白D(GSDMD)、Gasdermin家族蛋白D-N端(GSDMD-N)的表达水平,进一步探索细胞焦亡在银屑病中的作用。方法将进行期寻常型银屑病的30例患者纳入银屑病组(PSO组),收集30例患者的血清样本和其中20例患者的皮损样本,并收集同时期在苏北人民医院体检中心体检的30例健康者的血清和整形外科20例健康求美者的皮肤组织(皮损)纳入健康对照组(CON组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法(qRT-PCR)检测2组血清Caspase-1 mRNA的表达水平;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测2组血清Caspase-1的含量;采用蛋白免疫印迹法检测2组皮肤组织中Caspase-1蛋白的表达水平;采用免疫组织化学(IHC)法检测2组皮肤组织中GSDMD、GSDMD-N的表达及分布情况。结果PSO组患者血清中Caspase-1 mRNA表达水平高于CON组,差异有统计学意义(P<0.01)。PSO组血清中Caspase-1蛋白表达水平为(1047.74±276.20)pg/mL,高于CON组的(371.20±160.84)pg/mL,差异有统计学意义(P<0.01)。PSO组与CON组的Caspase-1总体蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);PSO组皮损中的Pro-Caspase-1蛋白表达水平低于CON组,Cleaved Caspase-1蛋白表达水平和GSDMD蛋白表达阳性率高于CON组,差异有统计学意义(P<0.01)。PSO组皮损中GSDMD-N蛋白表达阳性率高于CON组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论进行期寻常型银屑病患者血清及皮损中Caspase-1和皮损中GSDMD、GSDMD-N表达增加,提示细胞焦亡通路可能参与寻常型银屑病的发生和发展。