茯苓酸通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路调控铁死亡改善阿尔茨海默病大鼠认知障碍的研究

背景阿尔茨海默病(AD)是一种常见且不可逆转的神经退行性脑疾病,严重影响患者的生活品质和生存质量,目前仍缺乏有效的治疗方法延缓或阻止疾病进展。中药及其活性成分在防治AD方面具有重要潜力。目的探讨茯苓酸(PA)对AD大鼠认知障碍及核因子E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体家族7A11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路的影响。方法2022年1—9月将75只6~8周龄雄性SPF级SD大鼠依据随机数字表法分为对照组(Control组)、AD模型组(Model组)、PA治疗组(PA组),PA+Nrf2抑制剂组(PA+ML385组),除Control组外制备AD大鼠模型。造模成功后,PA组腹腔注射50 mg/kg PA,PA+ML385组腹腔注射50 mg/kg PA+30 mg/kg Nrf2抑制剂ML385,Control组与Model组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。末次给药24 h后进行Morris水迷宫实验,第2、4、6天进行定位航行实验,记录大鼠到达平台的时间(逃避潜伏期),第7天移走平台,记录大鼠在120 s内滞留平台时间和穿越平台次数。Nissl染色后观察各组大鼠海马神经元病理变化,普鲁士蓝染色检测海马组织铁沉积,免疫荧光染色检测海马神经元GPX4表达,检测海马组织谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、Fe2+含量,蛋白质印迹法(Western blotting)检测大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达。结果末次给药第2、4、6天Model组逃避潜伏期高于Control组、PA组,PA+ML385组高于PA组,差异有统计学意义(P<0.05);Model组平台停留时间、穿越平台次数低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05)。Nissl染色结果示Model组神经元坏死严重,细胞核皱缩,尼氏体数目减少;PA组神经元坏死减少,排列紧密且尼氏体增多;PA+ML385组神经元损伤明显加重,尼氏体数目减少。普鲁士蓝染色结果示Model组铁沉积较Control组增加,与Model组比较,PA组铁沉积减少,PA+ML385组较PA组铁沉积增多。免疫荧光染色结果示Model组绿色荧光减弱,GPX4阳性细胞减少,PA组细胞绿色荧光较Model组增强,GPX4阳性细胞增多,PA+ML385组较PA组GPX4阳性细胞减少。Model组GSH低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05);Model组MDA、Fe2+高于Control组、PA组,PA+ML385组高于PA组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Model组Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PA可改善AD大鼠认知障碍,其机制可能与通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡有关。

基于Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路探讨附芍地芩方抗结直肠癌作用机制

目的探讨附芍地芩方治疗结直肠癌的作用机制。方法体外细胞实验用附芍地芩方处理结直肠癌CT-26细胞,检测细胞增殖、迁移能力。流式细胞术检测结直肠癌CT-26细胞的活性氧(ROS)水平,并检测其铁离子(Fe^(2+))、丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性。PCR Array与Western blot方法分析验证铁死亡差异基因表达情况。体内动物实验将Balb/c小鼠随机分为空白对照组、模型组、奥沙利铂组(1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方低剂量组(4.49 g·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方中剂量组(8.97 g·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方高剂量组(17.94 g·kg^(-1)·d^(-1)),检测附芍地芩方对小鼠肿瘤组织Fe^(2+)、ROS、MDA水平,SOD活性及Nrf2、Keap1、SLC7A11、GPX4表达水平的影响。结果体外细胞实验显示,与空白对照组相比,附芍地芩方通过剂量依赖的方式显著抑制了结直肠癌CT-26细胞的增殖与迁移。附芍地芩方可以提高结直肠癌CT-26细胞中的Fe^(2+)(P<0.05)与ROS水平(P<0.01);提高结直肠癌CT-26细胞内MDA水平(P<0.01),并显著降低SOD活性(P<0.01)。铁死亡PCR Array分析发现,与空白对照组比较,附芍地芩方干预后,基因GPX4、SLC7A11表达显著下调,GSTA1、HMOX1、Ca9、Chac1、Keap1、Sqstm1、NOX1、FTH1、Tfr1、SAT2、Pparg、Hamp表达显著上调。Western blot实验检测发现,附芍地芩方干预后,结直肠癌CT-26细胞Keap1蛋白表达上调(P<0.01),Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达下调(P<0.01)。体内动物实验结果显示,附芍地芩方显著抑制小鼠皮下移植瘤的生长(P<0.05),肿瘤组织坏死程度增加,Fe^(2+)、ROS以及MDA水平增加(P<0.05,P<0.01),SOD活性下降(P<0.01),且肿瘤组织中Keap1蛋白表达上调(P<0.01),Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达下调(P<0.01)。结论附芍地芩方具有抗结直肠癌作用,并可能通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路促进结直肠癌细胞铁死亡以发挥抗结直肠癌作用。

参芪地黄汤通过GPX4信号通路调控糖尿病肾病小鼠铁死亡的机制研究

[目的]研究参芪地黄汤对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)模型小鼠的治疗效果及调控谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)信号通路对铁死亡的影响。[方法]通过链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)联合高脂饮食诱导建立DN小鼠模型,并灌胃不同剂量的参芪地黄汤。通过检测各组小鼠体质量、血糖、肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、24 h尿蛋白,肾石蜡切片苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色及过碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色评估参芪地黄汤对DN模型小鼠的治疗作用;通过检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)水平,评估参芪地黄汤对DN模型小鼠脂质过氧化水平的影响;通过检测总Fe水平以及转铁蛋白(transferin)、前列腺6跨膜上皮抗原3(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3,Steap3)蛋白水平评估参芪地黄汤对DN模型小鼠铁死亡的影响;通过检测还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(glutathione/oxidized glutathione,GSH/GSSG)水平以及溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、溶质载体家族3成员2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)、GPX4、谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamate cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)、谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase,GSS)蛋白水平来评估参芪地黄汤对DN模型小鼠GPX4信号通路的影响。[结果]与模型组比较,参芪地黄汤干预可明显提升DN模型小鼠体质量(P<0.01);降低DN小鼠血糖、Cr、BUN及24 h尿蛋白水平(P<0.05,P<0.01);同时改善DN模型小鼠肾组织病理学变化;降低MDA、ROS、4-HNE水平(P<0.01);降低总Fe水平(P<0.05,P<0.01)以及transferin、Steap3蛋白水平(P<0.05);升高GSH/GSSG比例(P<0.01)以及SLC7A11(P<0.05)、SLC3A2、GPX4、GCLC、GSS蛋白水平(P<0.05,P<0.01)。[结论]参芪地黄汤对DN模型小鼠具有治疗作用,并且可以减轻脂质过氧化水平,其作用机制可能与通过调控GPX4信号通路抑制铁死亡有关。

苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响

目的探讨苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响及其机制。方法体外培养脑胶质瘤U251细胞,将U251细胞分为对照组、苍术素低剂量组(5 mol/L)、中剂量组(10 mol/L)、高剂量组(20 mol/L)、ML385组(Nrf2抑制剂1 mol/L)。MTT和Edu实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;试剂盒检测亚铁离子(Fe^(2+))、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)水平;Western blot检测Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达;建立脑胶质瘤裸鼠模型,观察肿瘤生长情况,检测肿瘤组织中Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白水平。结果细胞实验结果显示,与对照组比较,苍术素低、中、高剂量组U251细胞Fe^(2+)、MDA、LDH、ROS水平、细胞凋亡率、cleaved-caspase3水平显著性升高,GSH水平、OD490(24 h、48 h)值和细胞增殖率、Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与苍术素高剂量组比较,ML385组U251细胞各检测指标水平无统计学差异(P>0.05);裸鼠成瘤实验结果表明,与模型组比较,苍术素组和ML385组裸鼠肿瘤质量和肿瘤体积、裸鼠肿瘤组织中Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著性降低,cleaved-caspase3蛋白表达水平显著性升高(P<0.05);与苍术素组比较,ML385组裸鼠肿瘤质量、肿瘤体积、抑瘤率和各蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)。结论苍术素可能通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路促进脑胶质瘤细胞铁死亡。

基于p53/SLC7A11/GPX4信号轴探讨七叶内酯诱导小鼠乳腺癌4T1细胞铁死亡的作用机制

目的:探讨七叶内酯对小鼠乳腺癌4T1细胞铁死亡的影响及其作用机制。方法:对七叶内酯与p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)进行分子对接,并绘制Kaplan-Meier和time ROC曲线。将4T1细胞分为对照组、1/2 IC_(50)组、IC_(50)组、2 IC_(50)组、erastin组和卡培他滨组。采用CCK-8法观察4T1细胞活力情况,筛选药物干预浓度;电镜观察4T1细胞线粒体形态,评估线粒体损伤情况;试剂盒检测4T1细胞活性氧(ROS)、Fe2+、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和GPX4的水平;采用划痕和Transwell小室实验检测4T1细胞侵袭和迁移能力;Western blot检测p53、SLC7A11、GPX4和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)的表达水平。结果:与对照组相比,七叶内酯1/2 IC_(50)、IC_(50)和2 IC_(50)组细胞活力,GSH和GPX4表达水平,侵袭和迁移能力,以及SLC7A11和GPX4蛋白表达水平均降低,细胞线粒体变小,膜密度增高,嵴减少(P<0.05),Fe2+、ROS和MDA水平及p53和ACSL4蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:七叶内酯可促进4T1细胞铁死亡,其作用机制可能与p53/SLC7A11/GPX4信号通路相关。

调控Nrf2/GPX4信号通路抑制铁死亡并缓解UUO小鼠肾纤维化

目的:评估单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型中调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路抑制铁死亡及肾脏纤维化的作用,检测慢性肾脏病(CKD)患者肾脏组织相关铁死亡及纤维化指标的表达情况。方法:收集9例CKD患者及9例非CKD患者肾穿标本石蜡切片,免疫组化法检测GPX4、Nrf2和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平。动物实验中,25只6~8周龄雄性C57BL/6小鼠采用简单随机抽样方法分为5组:假手术组、UUO模型组、UUO+liproxstatin-1(Lip-1;铁死亡抑制剂)组、UUO+萝卜硫素(SFN;Nrf2激动剂)组、UUO+厄贝沙坦(IRB)组,每组5只。正常饲料喂养1周,后3组分别腹腔注射Lip-1(10 mg·kg^(−1)·d^(−1))、SFN(25 mg·kg^(−1)·d^(−1))和IRB(20 mg·kg^(−1)·d^(−1))。取血清标本测定血清肌酐和尿素氮;肾脏组织石蜡包埋后行HE、Masson和Sirius red染色观察肾脏病理改变;Western blot、实时荧光定量PCR和免疫组化法检测小鼠肾脏组织Nrf2、GPX4、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、纤连蛋白(Fn)、I型胶原(Col-I)、α-SMA和NADPH氧化酶4(NOX4)的表达。结果:免疫组化结果显示,CKD患者肾脏组织石蜡切片GPX4和Nrf2表达低于非CKD患者,而α-SMA表达高于非CKD患者。动物实验中,与UUO组相比,3组用药组肾功能有改善,肾脏纤维化程度及相关指标表达减少;Lip-1和SFN用药组肾脏组织中Nrf2、GPX4和SLC7A11表达水平高于UUO组(P<0.05),NOX4表达水平低于UUO组(P<0.05)。结论:CKD患者及UUO小鼠肾脏纤维化及铁死亡显著增加;调控Nrf2/GPX4信号通路可抑制铁死亡并有效减轻UUO小鼠肾脏纤维化。

布洛芬对缺血性脑中风大鼠的神经保护作用及对Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路的影响

目的 探讨布洛芬调节核因子E2相关因子2(Nrf2)/非糖基化的x CT(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路对缺血性脑中风(IS)大鼠神经保护的作用。方法 48只以大脑中动脉梗死模型复制IS大鼠,将IS大鼠随机分为IS组、治疗组(30 mg/kg布洛芬)、抑制剂组(30 mg/kg ML385)、治疗+抑制剂组(30 mg/kg布洛芬+30 mg/kg ML385),其中以仅分离血管但不结扎的12只大鼠作为假手术组。干预结束后,对大鼠进行神经功能评分,检测大鼠脑梗死率以及脑水肿含量;取出大鼠脑组织,观察神经元形态学变化、检测铁离子含量变化以及Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路相关因子表达。结果 与假手术组相比,IS组神经功能评分、脑梗死率、脑水肿含量、铁离子含量显著增加,Nrf2、SLC7A11、GPX4表达显著降低(P <0.05);与IS组相比,治疗组神经功能评分、脑梗死率、脑水肿含量、铁离子含量显著下降,Nrf2、SLC7A11、GPX4表达显著增加(P <0.05);抑制剂组逆转了治疗组对IS大鼠神经保护。结论 布洛芬可以保护IS大鼠神经受损,可能与激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路有关。

京尼平苷通过调控SLC7A11/GPX4对氧糖剥夺/复氧损伤SH-SY5Y细胞的影响

目的研究京尼平苷(Gen)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y损伤的保护作用,并探讨其机制。方法将SH-SY5Y细胞分为对照组、OGD/R组及Gen低、中、高浓度组(12.5、25、50μmol·L^(-1))。除对照组外,其他各组细胞均建立OGD/R损伤模型,并采用不同浓度Gen进行干预。CCK-8检测细胞增殖活性;生化法检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平;比色法检测细胞内Fe2+水平;流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western blot检测细胞内谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和转铁蛋白受体1(TFR1)蛋白表达水平。结果与对照组比较,OGD/R组细胞LDH释放率、MDA含量、Fe2+水平、ROS水平和TFR1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而细胞增殖活性、SOD活性、GSH水平、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与OGD/R组比较,Gen各浓度组细胞LDH释放率、MDA含量、Fe2+水平、ROS水平和TFR1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而细胞增殖活性、SOD活性、GSH水平、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平显著升高(P<0.05),其中以H-Gen组最为显著(P<0.05)。结论Gen可抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激与铁死亡,其作用机制可能与激活SLC7A11/GPX4信号通路有关。

活血通降方对反流性食管炎大鼠食管损伤和xCT/VEGF-B/GPX4信号通路的影响

目的观察活血通降方对反流性食管炎(RE)大鼠食管损伤的影响,从xCT/VEGF-B/GPX4铁死亡信号通路探讨其作用机制。方法采用改良部分贲门肌切开术+外置幽门部分结扎术制备RE大鼠模型。将成模大鼠随机分为模型组及活血通降方低、高剂量组,每组12只,另取12只作为空白组。造模成功当日开始给药,活血通降方低、高剂量组给药剂量分别为3.68、7.35 g/(kg·d),每日早晚各1次,连续灌胃14 d,空白组和模型组予5 mL生理盐水灌胃。观察大鼠食管黏膜损伤情况,HE染色观察黏膜组织病理变化,试剂盒检测食管组织丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)含量,Western blot检测食管组织胱氨酸/谷氨酸反向转运体(xCT)、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达,ELISA检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-17、IL-10含量。结果与空白组比较,模型组大鼠食管黏膜损伤明显,肉眼及病理评分显著升高,食管组织MDA、ROS含量增加,GSH含量减少,xCT、VEGF-B、GPX4蛋白表达降低,血清IL-1β、IL-17含量增加,IL-10含量减少,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,活血通降方低、高剂量组大鼠食管黏膜损伤改善,肉眼及病理评分显著降低,食管组织MDA、ROS含量减少,xCT、VEGF-B、GPX4蛋白表达升高,血清IL-1β、IL-17含量减少,IL-10含量增加,活血通降方高剂量组大鼠食管组织GSH含量增加,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论活血通降方可缓解RE大鼠食管黏膜炎症,修复食管损伤,其机制可能与激活xCT/VEGF-B/GPX4信号通路,增加其抗氧化性,提高抗氧化因子GSH水平,清除食管中过多的ROS,调节相关炎症因子水平,影响食管细胞铁死亡有关。

银杏素调节Nrf2、SLC7A11、GPX4信号通路对卵巢癌细胞及铁死亡的影响

目的:探讨银杏素调节核因子E_(2)相关因子2(Nrf2)、非糖基化的xCT(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路对卵巢癌(OC)细胞增殖、凋亡和铁死亡的影响。方法:选取对数生长期SKOV3细胞,设置对照组、Nrf2激活剂-莱菔硫烷(SFN,20μmol SFN)组、银杏素低浓度组(2.5μM)、中浓度组(5μM)、高浓度(10μM)组、银杏素高浓度+SFN(10μM银杏素+20μmol SFN)组,对照组无需处理,其余各组按照相应药物浓度进行处理。MTT法检测各组SKOV3细胞增殖率;Western blot检测各组SKOV3细胞中Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平;qRT-PCR检测各组SKOV3细胞铁死亡影响因子SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平;流式细胞仪检测各组SKOV3细胞凋亡率;qRT-PCR检测各组SKOV3细胞铁死亡影响因子SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平;试剂盒检测各组SKOV3细胞铁水平变化;Western blot检测各组SKOV3细胞中Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平。结果:与对照组相比,SFN组增殖率(124.71±12.49)%、Nrf2(1.15±0.12)、SLC7A11(1.58±0.16)、GPX4(1.08±0.11)表达均升高,凋亡率(4.01±0.41)%、铁水平(24.73±2.48)下降(P<0.05),而银杏素低、中、高浓度组增殖率(74.22±7.43、51.03±5.11、35.23±3.53)%、Nrf2(0.62±0.07、0.41±0.05、0.18±0.02)、SLC7A11(0.56±0.06、0.37±0.04、0.16±0.02)、GPX4(0.61±0.07、0.43±0.05、0.21±0.03)表达均下降,凋亡率(14.55±1.46、28.17±2.82、42.01±4.21)%、铁水平(48.99±4.91、60.83±6.10、77.87±7.79)依次增加(均P<0.05);与银杏素高浓度+SFN组增殖率(65.09±6.51)%、Nrf2(0.48±0.05)、SLC7A11(0.46±0.05)、GPX4(0.55±0.06)表达相比,银杏素高浓度组增殖率、Nrf2、SLC7A11、GPX4表达及SFN组均有差异(均P<0.05)。结论:银杏素可以抑制OC细胞系SKOV3细胞的增殖,诱导其凋亡及铁死亡,可能与抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路有关。

灵芝酸A通过激活Nrf2/GPX4信号通路减轻七氟烷诱导的HT22细胞铁死亡

目的研究灵芝酸A(ganoderic acid A,GAA)对七氟烷诱导的HT22细胞铁死亡的影响和机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度GAA对HT22细胞的增殖活性,筛选出合适的GAA处理浓度。将HT22细胞分成对照组、七氟烷诱导组(Sev组)、GAA-25μmol/L组、GAA-50μmol/L组、GAA-100μmol/L组。对照组细胞按照常规方法处理;其他组均利用七氟烷进行诱导处理,同时不同浓度GAA组给予相应浓度的GAA干预。采用Western blot检测氧化应激相关因子(Nrf2、GPX4)与铁死亡相关因子(ACSL4、SLC7A11)的蛋白表达。利用相应的试剂盒检测Fe^(2+)、ROS、MDA、GSH、4-HNE等因子的含量。结果根据CCK-8实验结果,选择对HT22细胞增殖活性无影响的25、50、100μmol/L GAA进行后续研究。与对照组比较,Sev组的HT22细胞存活率降低(P<0.05),Nrf2、GPX4、ACSL4、SLC7A11蛋白表达减少(P<0.05),Fe^(2+)、ROS、MDA、4-HNE含量升高(P<0.05),GSH含量降低(P<0.05)。与Sev组比较,随着CAA处理浓度的升高,HT22细胞存活率显著升高(P<0.05),Nrf2、GPX4、ACSL4、SLC7A11蛋白表达增多(P<0.05),Fe^(2+)、ROS、MDA、4-HNE含量降低(P<0.05),GSH含量升高(P<0.05)。结论GAA通过激活Nrf2/GPX4信号通路减轻七氟烷诱导的HT22细胞铁死亡,从而发挥神经保护作用。GAA可作为治疗七氟烷麻醉神经损伤的潜在药物。

二甲双胍经Nrf2-Gpx4通路抑制铁死亡并减轻非酒精性脂肪性肝病大鼠的肝损伤

目的:基于核因子E2相关因子2(Nrf2)-谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)介导的铁死亡通路探究二甲双胍(Met)对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝损伤发挥保护作用的分子机制。方法:SPF级雄性SD大鼠给予高脂饲料喂养建立NAFLD模型,对照(control)组大鼠给予普通饲料喂养。喂养12周后,将模型大鼠随机分为NAFLD组、Met低剂量(Met-L)组、Met高剂量(Met-H)组和Met+brusatol(Nrf2抑制剂)组,每组8只。Met-L、Met-H组大鼠分别给予100、200 mg/kg Met灌胃,每天1次;Met+brusatol组大鼠在给予200 mg/kg Met灌胃的同时隔天腹腔注射2 mg/kg brusatol;control组和NAFLD组大鼠给予等量生理盐水灌胃和腹腔注射,连续6周。给药结束后,检测血清中肝功能相关指标[天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)和丙氨酸氨基转氨酶(ALT)]、血脂[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)]及炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素6(IL-6)]的水平;比色法检测肝组织匀浆中铁离子含量,TBA法检测丙二醛(MDA)含量,微量酶标法检测谷胱甘肽(GSH)含量,DCFH-DA荧光探针法检测活性氧(ROS)含量;HE染色检测肝组织病理学变化;油红O染色检测肝细胞脂质积累情况;普鲁士蓝染色检测肝脏中铁沉积情况;Western blot和RT-qPCR检测肝组织中Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、Gpx4及胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白(xCT)的蛋白和mRNA的表达。结果:与control组相比,NAFLD组血清ALT、AST、TNF-α、IL-6、TC、TG和LDL-C水平、肝组织铁离子含量、MDA和ROS水平、肝组织NAS评分、油红O染色及普鲁士蓝染色阳性面积百分比显著升高(P<0.05),血清HDL-C水平、肝组织GSH含量及Nrf2、HO-1、Gpx4和xCT的蛋白和mRNA表达显著降低(P<0.05),肝细胞排列紊乱、肿胀,细胞内存在脂滴空泡,有明显的炎症细胞浸润、脂质蓄积和铁沉积;与NAFLD组相比,Met-L和Met-H组血清ALT、AST、TNF-α、IL-6、TC、TG和LDL-C水平、肝组织铁离子含量、MDA和ROS水平、肝组织NAS评分、油红O染色及普鲁士蓝染色阳性面积百分比显著降低(P<0.05),血清HDL-C水平、肝组织GSH含量及Nrf2、HO-1、Gpx4和xCT的蛋白和mRNA表达显著升高(P<0.05),肝细胞脂肪变性减轻,炎症细胞浸润、脂质蓄积和铁沉积减少;Nrf2抑制剂brusatol能明显逆转Met对Nrf2/Gpx4通路的激活作用以及NAFLD大鼠肝脏的保护作用。结论:二甲双胍可能通过激活Nrf2/Gpx4通路,抑制铁死亡,减轻脂质过氧化程度,从而对NAFLD大鼠肝脏发挥保护作用。

从肝治心组方调控SLC7A11/GPX4介导的铁死亡对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

目的基于SLC7A11/GPX4介导的铁死亡途径探讨从肝治心组方对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法45只SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、从肝治心组方组和地尔硫?组,制备心肌缺血再灌注大鼠模型,并予相应药物灌胃14 d。ELISA检测血清丙二醛(MDA)、肌钙蛋白T(c TnT)、超氧化物歧化酶(SOD)含量和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性,生化法检测血清谷胱甘肽(GSH)含量,HE染色观察心肌组织病理形态,透射电镜观察心肌细胞超微结构,普鲁士蓝染色观察心肌细胞铁沉积水平,免疫组化检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)阳性表达,Western blot和RT-PCR检测心肌组织溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽合成酶(GSS)、GPX4蛋白及m RNA表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠血清MDA、cTnT含量和CK-MB活性显著升高,SOD、GSH含量显著降低(P<0.01),心肌纤维断裂、排列紊乱,细胞肿胀伴炎性细胞浸润,胞质空泡样变性,胞膜破裂,线粒体嵴断裂、排列不规则,铁沉积显著增加(P<0.01),心肌组织SLC7A11、GSS、GPX4蛋白和mRNA表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,从肝治心组方组和地尔硫?组大鼠血清MDA、cTnT含量和CK-MB活性显著降低,SOD、GSH含量显著升高(P<0.05,P<0.01),心肌纤维排列较规则,细胞肿胀减轻,胞膜相对完整,线粒体结构改善,铁沉积显著减少(P<0.01),心肌组织SLC7A11、GPX4蛋白和mRNA表达显著升高(P<0.01)。结论从肝治心组方可改善心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤,减少心肌组织铁沉积,其机制可能与调控SLC7A11/GPX4信号通路从而抑制铁死亡有关。

基于Nrf2/HO-1/GPX4信号通路探讨真武汤改善脾肾阳虚型糖尿病肾病小鼠的作用机制

目的:基于核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路探讨真武汤对脾肾阳虚型糖尿病肾病(DKD)小鼠肾脏氧化损伤的干预作用及机制。方法:将25只7周龄SPF级雄性db/m小鼠及95只7周龄SPF级雄性db/db小鼠适应性喂养1周。db/m小鼠作为空白组,其余小鼠进行运用灌服生大黄溶液和氢化可的松制备脾肾阳虚型DKD模型,成模后随机分为模型组、厄贝沙坦组(25 mg·kg^(-1))、真武汤高、中、低剂量(33.8、16.9、8.45 g·kg^(-1))组,每组15只,连续灌胃8周。观察小鼠生存状态和计算中医证候评分并测定脾肾阳虚相关、空腹血糖(FBG)及肾功能相关指标;苏木素-伊红(HE)染色观察各组肾脏组织病理学改变;生化试剂盒法测定肾组织中氧化应激相关指标;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、GPX4 m RNA和蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠中医证候积分明显升高(P<0.05),雌二醇(E2)含量明显升高(P<0.05),睾酮(T)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)含量明显降低(P<0.05);FBG明显升高(P<0.05),肾功能明显下降(P<0.05);肾脏病理显示肾小球肥大,肾小球系膜和基底增厚明显,肾组织中过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)、还原型谷胱甘肽(GSH)水平均明显降低(P<0.05),丙二醛(MDA)的含量明显升高(P<0.05),肾组织中Nrf2、HO-1、GCLC、GPX4 m RNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.05);与模型组比较,真武汤高、中剂量组中医证候积分明显降低、E2含量明显降低(P<0.05),T、T3、T4含量明显升高(P<0.05);肾功能明显改善(P<0.05),肾脏病理明显改善,真武汤高、中剂量组小鼠肾组织中CAT、T-AOC、GSH水平均明显升高(P<0.05),MDA的含量明显下降(P<0.05),各给药组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1、GCLC、GPX4 m RNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:真武汤改善脾肾阳虚型db/db小鼠一般状态、肾功能,降低氧化损伤和减轻肾脏病理改变,其作用机制可能与调节Nrf2/HO-1/GPX4通路有关。

GPX4失活通过JNK通路缓解LPS诱导巨噬细胞炎症反应

【目的】研究硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidases 4,GPX4)失活如何参与调控脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应及其潜在的分子机制。【方法】体外培养RAW264.7巨噬细胞,以DMSO为对照,使用0.1~5.0μmol/L GPX4抑制剂FIN56处理,通过CCK-8法检测细胞活力和Western blotting检测GPX4蛋白表达水平,确定抑制剂最适浓度。将RAW264.7巨噬细胞分为4组:对照组,添加DMSO培养24 h;FIN56(GPX4抑制剂)组,添加0.5μmol/L FIN56培养24 h;DMSO-LPS组,DMSO培养24 h后使用LPS(100 ng/mL)刺激3 h;FIN56-LPS组,FIN56培养24 h后使用LPS刺激3 h。各组细胞经培养后,利用荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,HDCFDA)检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,使用试剂盒法检测细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,分别使用ELISA和荧光定量PCR检测促炎细胞因子白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌水平和基因表达量,使用Western blotting法检测Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)信号通路相关蛋白表达水平。【结果】与DMSO处理相比,0.5μmol/L FIN56处理巨噬细胞24 h对细胞活性无显著影响(P>0.05),且显著降低GPX4蛋白表达水平(P<0.05),故选用0.5μmol/L FIN56用于后续实验。与对照组相比,FIN56和LPS均显著增加了ROS积累(P<0.05),而与DMSO-LPS组相比,FIN56-LPS组ROS水平显著升高(P<0.05)。与对照组相比,LPS可显著增加小鼠巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达量和IL-6含量,以及c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK)和c-Jun磷酸化水平(P<0.05),而FIN56可显著下调LPS诱导的IL-6的mRNA表达量和含量及JNK和c-Jun磷酸化水平(P<0.05),但对p38蛋白(p38 MAPK,p38)、细胞外调节蛋白激酶(phosphorylate extracellular regulated protein kinases1/2,Erk1/2)蛋白表达水平无显著影响(P>0.05)。【结论】GPX4失活可有效阻断JNK和c-Jun磷酸化,从而特异性抑制LPS诱导的巨噬细胞的炎症反应。该结果可为以GPX4为靶点研发抗炎治疗策略提供理论依据。

基于HSPA5/GPX4信号通路探讨针刀干预膝关节骨关节炎兔软骨细胞铁死亡的作用机制

目的:观察针刀疗法对膝关节骨关节炎(KOA)兔膝关节软骨细胞热休克蛋白A家族成员5(HSPA5)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路的影响,探讨针刀干预KOA软骨细胞铁死亡的作用机制。方法:将27只新西兰兔随机分为正常组、模型组和针刀组,每组9只。采用改良Videman法连续固定兔左侧后肢6周建立KOA模型。造模后,针刀组给予针刀干预,每周1次,连续3周。运用奎森功能障碍指数(Lequesne MG评分)评估兔膝关节局部症状、体征及功能;HE染色法与番红-固绿染色法分别观察兔软骨细胞与组织形态;透射电镜观察兔软骨细胞线粒体结构;运用铁离子试剂盒检测兔软骨组织铁含量;流式细胞仪检测兔软骨组织线粒体膜电位(Δψm)和活性氧(ROS)水平,并计算线粒体损伤率;实时荧光定量PCR检测兔软骨组织HSPA5、GPX4、Ⅱ型胶原α1链(COL2A1)、基质金属蛋白酶(MMP)3、MMP13 mRNA表达;Western blot法检测兔软骨组织HSPA5、GPX4、Ⅱ型胶原蛋白(COL-Ⅱ)、MMP3、MMP13蛋白表达;免疫荧光法检测兔软骨组织HSPA5、GPX4平均荧光强度。结果:干预前,与正常组比较,模型组和针刀组兔膝关节Lequesne MG评分升高(P<0.01);干预后,与模型组比较,针刀组兔膝关节Lequesne MG评分降低(P<0.01)。与正常组比较,模型组兔膝关节软骨细胞数量减少且排列紊乱,软骨结构层次不清,潮线紊乱、模糊不清,线粒体皱缩、线粒体嵴减少甚至消失;与模型组比较,针刀组软骨细胞数量较多,软骨结构层次清楚,潮线恢复,线粒体数量较多,结构正常,有较多的嵴。与正常组比较,模型组软骨组织铁含量增加(P<0.01),细胞呈低Δψm,线粒体损伤率增高(P<0.01),ROS平均荧光强度升高(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4、COL2A1 mRNA及相应蛋白表达降低(P<0.01),软骨组织MMP3、MMP13 mRNA及蛋白表达升高(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4平均荧光强度降低(P<0.01);与模型组比较,针刀组软骨组织铁含量减少(P<0.01),软骨细胞Δψm升高,线粒体损伤率降低(P<0.01),ROS平均荧光强度降低(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4、COL2A1 mRNA及相应蛋白表达升高(P<0.01),软骨组织MMP3、MMP13 mRNA和蛋白表达降低(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4平均荧光强度升高(P<0.01)。结论:针刀干预能够缓解KOA模型兔膝关节软骨损伤,其机制可能与调节HSPA5/GPX4信号通路维持关节软骨铁稳态,从而抑制软骨细胞铁死亡,缓解细胞外基质(ECM)降解有关。

白藜芦醇通过激活p53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡减少脑缺血再灌注损伤

目的探讨白藜芦醇对脑缺血再灌注后铁死亡的抑制作用及其机制。方法250~280 g的SPF级SD雄性大鼠63只,随机分为假手术组、脑缺血再灌注组(MCAO/R)组、白藜芦醇组。利用线栓法建立大鼠疾病模型。给药组剂量为30 mg/kg。给药28 d后应用Zea-longa评分评估大鼠神经功能。给药24 h取材大鼠脑组织,通过称重法评估脑水肿情况,应用免疫荧光染色检测谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4),长链脂酰辅酶A合成酶4(long chain lipoyl coenzyme A synthetase 4,ACSL4)。试剂盒检测各组脑组织中Fe^(2+)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平。利用蛋白免疫印记(Western Blot)对不同组别的大鼠脑组织中p53、SLC7A11以及GPX4蛋白表达进行检测。结果与损伤组相比,白藜芦醇治疗组Zea-longa评分和脑组织水含量、Fe^(2+)、MDA明显降低,GSH、SOD表达明显增加;免疫荧光染色结果显示,GPX4表达明显增强、ACSL4表达降低。WB通路蛋白结果显示,白藜芦醇治疗组P53表达降低,SLC7A11表达升高。结论白藜芦醇通过调控p53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制MCAO/R大鼠铁死亡,进而促进缺血再灌注大鼠神经功能恢复。

姜黄素通过调控p53/SLC7A11/GPX4通路抑制脂多糖诱导的RAW264.7源性破骨细胞分化

目的:探讨姜黄素(Cur)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7源性破骨细胞的作用及其机制。方法:用LPS诱导RAW264.7细胞建立破骨细胞模型。CCK-8法检测RAW264.7细胞活力;TRAP染色鉴定破骨细胞形成;TRAP活性测定检测破骨细胞活力;生化检测细胞活性氧(ROS)、Fe^(2+)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)水平;透射电镜观察细胞线粒体形态;RT-qPCR检测p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)及谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的mRNA水平;Western blot检测p53、SLC7A11及GPX4蛋白水平。结果:LPS成功诱导RAW264.7细胞为破骨细胞。TRAP染色及TRAP活性结果显示,与LPS组相比,Cur组破骨细胞数量及TRAP活性呈剂量依赖式下降(P<0.01);与Con组相比,LPS+Erastin组TRAP活性显著升高(P<0.01),经Cur处理后,TRAP活性呈剂量依赖式下降(P<0.01)。生化检测结果显示,与Con组比较,LPS+Erastin组ROS、Fe^(2+)及MDA水平显著升高,GSH水平显著降低(P<0.01);与LPS+Erastin组相比,Cur组ROS、Fe^(2+)及MDA水平呈剂量依赖式下降(P<0.01),GSH水平呈剂量依赖式上升(P<0.01)。电镜结果显示,与LPS组比较,LPS+Erastin组细胞线粒体嵴减少,膜密度增加;经Cur处理后,细胞线粒体嵴明显增加,膜密度减小。RT-qPCR和Western blot结果显示,与Con组比较,LPS+Erastin组p53的mRNA和蛋白水平显著升高,SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.01);经Cur处理后,p53的mRNA和蛋白水平显著降低,SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.01)。结论:Cur可抑制LPS诱导的RAW264.7源性破骨细胞分化,其机制可能与p53/SLC7A11/GPX4信号通路被抑制有关。

罗汉果皂苷V对RSL3诱导的SH-SY5Y细胞铁死亡的抑制作用及其机制

目的:探讨罗汉果皂苷V(MV)对铁死亡诱导剂RAS选择性致死分子3(RSL3)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞铁死亡的抑制作用及可能机制。方法:用RSL3诱导SH-SY5Y细胞建立铁死亡模型。MTT法检测细胞活力;倒置显微镜观察细胞形态;亚铁离子荧光探针FerroFarRed检测细胞内亚铁离子含量;线粒体红色荧光探针MitoTracker Red CMXRos检测线粒体膜电位(MMP);超氧化物阴离子荧光探针二氢乙啶和线粒体超氧化物红色荧光探针MitoSoX Red分别检测细胞内和线粒体内活性氧(ROS)。微板法检测细胞谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平。Western blot检测脂酰辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)、环加氧酶2(COX-2、)谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白表达水平。分子对接技术预测MV与ACSL4、COX-2、GPX4和SLC7A11的靶向关系。结果:与control组相比,RSL3组SH-SY5Y细胞活力显著降低(P<0.01),细胞内亚铁离子含量、细胞内和线粒体内ROS水平及MDA水平显著升高(P<0.05或P<0.01),MMP和GSH水平显著降低(P<0.01),ACSL4和COX-2蛋白表达水平显著升高,而GPX4和SLC7A11蛋白表达水平显著降低(P<0.01),提示成功建立了细胞铁死亡模型。MV处理使细胞活力显著升高(P<0.05),细胞内亚铁离子含量、细胞内和线粒体内ROS水平及MDA水平显著降低(P<0.01),MMP和GSH水平显著升高(P<0.05或P<0.01);ACSL4和COX-2蛋白水平显著降低,而GPX4和SLC7A11蛋白水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。分子对接结果显示,MV与铁死亡核心蛋白ACSL4、COX-2、GPX4和SLC7A11存在结合位点。结论:MV可抑制RSL3诱导的SH-SY5Y细胞铁死亡的发生,其机制可能与激活SLC7A11/GPX4和抑制ACSL4/COX-2有关。

基于Nrf2/HO-1/GPX4通路探讨大戟脂总三萜抗类风湿性关节炎的作用

旨在探讨大戟脂总三萜对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的防治作用及其作用机制。采用完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant,FCA)诱导大鼠关节炎模型,将雄性大鼠随机分为6组,每组10只,分别为对照组,模型组,雷公藤多苷(7.5 mg·kg^(-1))组,大戟脂总三萜低、中、高剂量组(32、64、128 mg·kg^(-1));除对照组大鼠外,在大鼠右后足趾注射0.2 mL FCA。给药组灌胃给予药物,对照组和模型组给予相应体积0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,每日1次,期间测量大鼠后足肿胀度并进行关节炎评分至第30天。给药结束后,采用HE染色观察大鼠关节组织病理学改变。采用生化比色法检测关节组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)因子和Fe^(2+)的含量以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。采用RT-PCR法检测关节组织中核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(gluta-thione peroxidase 4,GPX4)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)mRNA的含量,Western blot法检测大鼠关节组织中Nrf2、Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化还原酶1[NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1]、超氧化物歧化酶(SOD2)、GPX4、ACSL4蛋白的表达。结果显示,与模型组比较,经雷公藤多苷(7.5 mg·kg^(-1))和大戟脂总三萜(32、64、128 mg·kg^(-1))治疗后,大鼠双侧后肢肿胀程度明显减轻,关节炎评分显著下降,关节组织病变程度减轻;关节组织中MDA和Fe^(2+)含量降低,GSH含量和SOD活性增加;氧化因子Nrf2、GPX4的蛋白表达和mRNA水平显著增加,ACSL4的蛋白表达和mRNA相对含量显著降低;Nrf2/HO-1/GPX4通路的Keap1、NQO1、HO-1、SOD2蛋白表达水平也显著升高。综上所述,大戟脂总三萜可通过抑制脂质过氧化从而抑制细胞异常铁死亡发挥抗RA作用,作用机制可能与其对Nrf2/HO-1/GPX4信号通路的调控相关。