延龄草皂苷对脑缺血大鼠梗死灶周围皮层少突胶质细胞GSK-3/β-catenin/CRMP2信号表达的影响

目的观察延龄草皂苷(TSTT)对脑缺血大鼠梗死灶周围皮层少突胶质细胞GSK-3/β-catenin/CRMP2信号表达的影响,探讨其改善脑缺血损伤的作用机制。方法采用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型,将大鼠随机分为假手术组、模型组、TSTT 65 mg/kg组、TSTT 33 mg/kg组和金纳多组,各给药组灌胃相应药物,连续15 d。HE染色观察脑组织病理变化,LFB染色观察脑组织神经纤维损伤,免疫荧光染色检测梗死灶周围皮层2′,3′-环核苷酸-3′-磷酸二酯酶(CNPase)、蛋白聚糖(NG2)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、β-连环蛋白(β-catenin)表达,实时荧光定量PCR检测梗死灶周围皮层GSK-3、β-catenin、脑衰蛋白反应调节蛋白-2(CRMP2)基因表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠患侧脑组织明显坏死,神经细胞大量死亡,胞体皱缩,单位面积神经细胞数量显著减少(P<0.01),神经纤维丢失、排列混乱,髓鞘中有大量空泡,神经纤维相对积分光密度显著减少(P<0.01);与模型组比较,TSTT 65、33 mg/kg组大鼠神经细胞形态有所改善,单位面积神经细胞数量显著增加(P<0.05,P<0.01),神经纤维排列较有序,髓鞘中空泡较少,神经纤维相对积分光密度显著增加(P<0.01)。免疫荧光染色结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠梗死灶周围皮层CNPase阳性表达显著降低,NG2阳性表达显著升高(P<0.01),NG2/GSK-3β、NG2/β-catenin、CNPase/GSK-3β、CNPase/β-catenin阳性细胞显著增加(P<0.01);与模型组比较,TSTT 65、33 mg/kg组大鼠梗死灶周围皮层CNPase、NG2表达显著升高,CNPase/GSK-3β、NG2/GSK-3β阳性细胞显著减少,CNPase/β-catenin、NG2/β-catenin阳性细胞显著增加(P<0.05,P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠梗死灶周围皮层GSK-3αmRNA表达显著升高(P<0.05),β-catenin、CRMP2 mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,TSTT 65 mg/kg组大鼠梗死灶周围皮层GSK-3α、GSK-3βmRNA表达显著降低,β-catenin和CRMP2 mRNA表达显著升高(P<0.05)。结论TSTT可减轻脑缺血大鼠脑组织损伤,保护少突胶质细胞,促进少突胶质前体细胞存活,其机制可能与下调GSK-3表达,上调β-catenin、CRMP2表达有关。

大蒜素通过GSK-3β/β-catenin信号通路抑制舌鳞状细胞癌EMT的研究

本研究旨在探讨大蒜素(Allicin)对舌鳞状细胞癌上皮向间充质转化(EMT)的影响,并探究其作用机制。本实验采用CCK-8法检测不同剂量大蒜素对HSC-3和HSC-4细胞的生存作用并计算半数抑制作用(IC_(50));划痕和Transwell小室实验测定大蒜素对细胞的迁移能力和侵袭影响;Western Blot检测蛋白表达。结果显示,大蒜素对HSC-3和HSC-4细胞活性有抑制作用且具有时间和剂量依赖性;不同浓度(20、40、60μmol/L)的大蒜素能够抑制HSC-3和HSC-4细胞迁移和侵袭;Western Blot结果显示大蒜素能够升高EMT标志物E-cadherin表达,降低N-cadherin和Vimentin表达,同时对GSK-3β/β-catenin信号通路中P-GSK-3β和β-catenin蛋白起到抑制作用。结果表明,大蒜素能够抑制舌鳞状细胞癌HSC-3和HSC-4细胞侵袭和迁移,其机制可能是通过抑制GSK-3β/β-catenin信号通路逆转EMT发生实现的。

miR-152-3p通过AKT/GSK-3β/Nrf2信号通路促进脑出血大鼠神经元铁死亡

目的:探讨miR-152-3p通过AKT/GSK-3β/Nrf2信号通路促进脑出血(ICH)大鼠神经元铁死亡的机制。方法:使用大鼠神经元细胞为研究对象,采用氧合血红蛋白(oxyHb)刺激神经元细胞构建ICH体外细胞模型,分别将miR-152-3p inhibitor和(或)PIK3CA抑制剂分别处理细胞,采用流式细胞术观察细胞凋亡情况,RT-qPCR、Western blot检测相关基因和蛋白表达情况;并用细胞免疫荧光观察Nrf2蛋白的入核率;用双荧光素酶靶标实验验证miR-152-3p与PIK3CA的关系。结果:将miR-152-3p inhibitor转染的细胞构建ICH细胞模型后,细胞凋亡率明显降低(P<0.01);SLC7A11、GPx4、PIK3CA、Nrf2蛋白表达水平以及p-AKT/AKT比率显著升高而GSK-3β蛋白表达水平显著降低(P<0.01);同时,Nrf2蛋白入核量也显著升高(P<0.01);而此作用在使用PIK3CA抑制剂干预后,miR-152-3p inhibitor的改善效果消失;荧光素酶靶标实验证实,miR-152-3p可靶向调控PIK3CA。结论:miR-152-3p通过AKT/GSK-3β/Nrf2信号通路促进ICH大鼠神经元铁死亡。

人参多糖调控Wnt3/β-catenin/Runx2信号通路改善去卵巢大鼠骨质疏松的作用

目的探究人参多糖改善去卵巢大鼠骨质疏松的作用及对Wnt3/β-catenin/Runx2信号通路的影响。方法将大鼠分为假手术组、模型组、人参多糖低、高剂量组(100、200 mg/kg)及阿仑膦酸钠维生素D3组(6.25 mg/kg),每组10只,采用去卵巢法建立骨质疏松症模型。连续干预12周,记录体质量,观察骨组织病理形态,检测骨密度、骨生物力学、血清骨代谢及生化指标,同时测定骨组织Wnt3、β-catenin及Runx2表达。结果与模型组比较,人参多糖低、高剂量组大鼠体质量明显降低(P<0.01),骨组织病理形态减轻,骨密度、刚度、最大应力及最大载荷均明显增加(P<0.05,P<0.01);血清TRAP-5b含量明显降低(P<0.05,P<0.01),而BALP、OC、OPG及P^(3+)、Ca^(2+)含量明显升高(P<0.05,P<0.01);骨组织Wnt3、β-catenin及Runx2表达均明显增加(P<0.05,P<0.01)。结论人参多糖具有改善去卵巢大鼠骨质疏松的作用,其机制可能与激活Wnt3/β-catenin/Runx2信号通路有关。

基于GSK-3β/Fyn/Nrf2信号通路探讨槲皮素对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响及内在机制

目的:探究槲皮素在自发性高血压大鼠(SHR)心肌纤维化中的作用机制。方法:50只SHR随机分为SHR组、卡托普利组、槲皮素低、中、高剂量组,每组10只;10只Wky大鼠为Wky组。卡托普利组灌胃给予卡托普利30 mg/kg,槲皮素低、中、高剂量组分别灌胃给予槲皮素20、50、100 mg/kg,Wky组、SHR组给予等量0.9%氯化钠溶液,每天1次,连续12周。尾袖法每2周测定大鼠尾动脉收缩压(SBP);给药结束,称定心脏质量,大鼠处死,称定其左心室质量(LVM),计算左心室肥厚指数(LVMI);比色法测血清超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)活性、丙二醛(MDA)含量;实时荧光定量-聚合酶链式反应法和Western blot法检测左心室组织中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、非受体酪氨酸激酶Fyn、核因子相关因子2(Nrf2)的mRNA、蛋白表达,以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原(Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ)蛋白表达。结果:与Wky组比较,SHR组大鼠SBP、心脏质量、LVMI显著升高(P<0.01);血清SOD、T-AOC活性显著降低,MDA含量显著增加(P<0.01);左心室Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ表达显著升高(P<0.01),Nrf2、GSK-3β的mRNA、蛋白表达显著降低(P<0.01),Fyn的mRNA、蛋白表达显著升高(P<0.01)。与SHR组比较,卡托普利组、槲皮素低、中、高剂量组大鼠SBP、心脏质量、LVM、LVMI均显著降低(P<0.01);血清SOD、T-AOC活性显著升高,MDA含量显著降低(P<0.05,P<0.01);槲皮素中、高剂量组左心室中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ蛋白表达显著降低(P<0.01);槲皮素低、中、高剂量组左心室中Nrf2、GSK-3βmRNA、蛋白表达显著升高,Fyn mRNA、蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论:槲皮素可抑制SHR心肌纤维化,其机制可能是通过下调GSK-3β/Fyn信号通路,激活Nrf2诱导的抗氧化通路,减少SHR心肌组织氧化应激反应。

WNT3A结合并稳定FZD2激活Wnt通路促进成骨细胞增殖和分化的分子机制研究

目的:探讨配体WNT3A通过稳定和激活FZD2(Frizzled2)增加成骨细胞骨形成的活性及其分子机制。方法:24只雌性6~8周龄C57BL/6J小鼠随机分为4组,对照(Control)组,假手术(Sham)组,双侧卵巢摘除术(ovariectomy,OVX)诱导骨质疏松症(Osteoporosis,OP)小鼠模型组(OVX组),OVX+雌二醇治疗组(OVX+E2 Treatment组),每组6只小鼠。建立OVX小鼠模型。Western blot法测定小鼠后肢胫骨组织中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2以及磷酸化(p-)STAT3、STAT3、p-JAK2和JAK2的表达水平。CCK-8测定小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1的增殖能力。腺病毒-shRNA-FZD2介导敲低MC3T3-E1细胞中的FZD2。免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation,co-IP)法测定WNT3A处理MC3T3-E1细胞前后FZD2与泛素(ubiquitin,Ub)的直接结合情况。结果:与OVX组相比,OVX+E2 Treatment组小鼠胫骨组织中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表达水平均被上调(P<0.05)。与Control组相比,WNT3A Treatment组MC3T3-E1细胞中FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表达水平均升高(P<0.05);细胞增殖能力增强(P<0.05)。与WNT3A Treatment组相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2组FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表达水平均降低(P<0.05);p-STAT3和p-JAK2的磷酸化水平均降低(P<0.05);增殖能力降低(P<0.05);而2组细胞中STAT3和JAK2的表达水平无统计学差异(P>0.05)。在IP:Ub组中,与WNT3A处理(-)的细胞相比,WNT3A处理(+)的细胞中FZD2的表达水平升高(P<0.05)。结论:WNT3A的促骨合成代谢活性是通过结合并稳定FZD2激活Wnt/β-Catenin信号通路实现的。

鸢尾苷元通过GSK-3β/Nrf2信号通路减轻Aβ_(1-42)诱导的SH-SY5Y细胞损伤

目的:探讨鸢尾苷元对β淀粉样蛋白(Aβ)_(1-42)诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及其潜在机制。方法:以Aβ_(1-42)诱导人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y建立阿尔茨海默病(AD)神经元损伤模型,MTT检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;相关试剂盒检测LDH、Caspase-3、氧化应激和GSK-3β水平;免疫荧光法检测4-HNE表达;PDB数据库和分子对接预测鸢尾苷元和GSK-3β的结合;Western Blot分析凋亡和GSK-3β/Nrf2通路相关蛋白表达。结果:鸢尾苷元可呈浓度依赖性缓解Aβ_(1-42)诱导的SH-SY5Y细胞活力损伤、凋亡及氧化应激,并可通过靶向GSK-3β从而调控GSK-3β/Nrf2信号。结论:鸢尾苷元可通过调控GSK-3β/Nrf2通路进而抑制Aβ_(1-42)诱导的SH-SY5Y细胞损伤。

METTL14通过PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路调控巨噬细胞分化对宫颈癌细胞凋亡和增殖的影响

目的探讨METTL14通过调控巨噬细胞分化抑制宫颈癌病理性发展及相关机制。方法检测宫颈癌病变样本METTL14 m RNA和蛋白,以及IL-6、iNOS、Arg-1和CD206表达变化。PMA诱导THP-1细胞转化为巨噬细胞,慢病毒过表达或抑制METTL14表达,检测IL-6、iNO、Arg-1和CD206表达变化以及PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路相关蛋白表达情况。随后加入PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路激动剂和抑制剂,检测过表达或抑制METTL14后,巨噬细胞IL-6、iNO、Arg-1和CD206表达变化,并取其上清制成条件培养基,孵育Hela细胞,检测细胞凋亡和增殖情况。结果1)宫颈癌病变组织中METTL14 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),巨噬细胞M1型标志物IL-6和iNOS表达明显降低(P<0.05),而M2型标志物Arg-1和CD206表达明显升高(P<0.05)。2)巨噬细胞过表达METTL14后,IL-6和iNOS表达明显升高(P<0.05),而Arg-1和CD206表达明显降低(P<0.05),M1/M2比例升高;抑制METTL14表达后,M1型标志物降低(P<0.05),M2型标志物升高(P<0.05),M1/M2比例降低。3)巨噬细胞中转染OE-METTL14慢病毒组PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路被抑制(P<0.05);加入PI3K/AKT激动剂后,M1型标志物降低而M2型标记物升高(P<0.05),M1/M2比例降低;OE-METTL14可逆转此趋势。Sh-METTL14慢病毒组PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路被激活(P<0.05),加入PI3K/AKT抑制剂后,M1型标志物升高而M2型标记物降低(P<0.05),M1/M2比例升高;Sh-METTL14可逆转此趋势。4)取转染OE-METTL14慢病毒后的巨噬细胞上清培养Hela细胞,可见细胞凋亡明显增多(P<0.05),增殖明显减少(P<0.05)。Sh-METTL14组的Hela细胞则表现出细胞凋亡减少(P<0.05),增殖增多(P<0.05)。结论METTL14通过PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路调控巨噬细胞分化可能有促进宫颈癌细胞凋亡,抑制增殖的作用。

补中益气汤含药血清调控GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路增强A549细胞对顺铂敏感性的研究

目的:探讨补中益气汤含药血清增强A549细胞对顺铂敏感性的机制是否与GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路有关。方法:制备补中益气汤含药血清作用于A549细胞株,随机分为a组(对照血清组)、b组(顺铂组)、c组(补中益气汤组)、d组(补中益气汤含药血清联合顺铂组)。流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测GSK-3β、p-GSK-3β^(ser9)、p-GSK-3β^(tyr216)、β-catenin、survivin蛋白表达。结果:补中益气汤含药血清联合顺铂可降低p-GSK-3β^(ser9)、β-catenin、survivin蛋白表达,提高晚期细胞凋亡率。结论:抑制GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路激活可能是补中益气汤含药血清增强A549细胞对顺铂敏感性的作用机制之一。

木犀草素通过GSK-3β/β-catenin通路抑制胶质母细胞瘤细胞侵袭、迁移及上皮间质转化

目的:研究木犀草素对人胶质瘤U87及U251细胞侵袭、迁移能力的影响及其机制。方法:体外培养胶质瘤U87及U251细胞系,将对数生长期细胞随机分为对照组及木犀草素处理组,利用CCK-8实验检测细胞活力,划痕实验及Transwell实验检测胶质瘤细胞迁移侵袭能力,Western blot实验及免疫荧光实验检测木犀草素对胶质瘤细胞上皮间质转化相关蛋白及GSK-3β/β-catenin信号通路的影响;使用GSK-3β/β-catenin信号通路抑制剂(G?6983)或激动剂(LiCl)处理U87及U251细胞验证木犀草素对U87及U251细胞相关蛋白表达及侵袭迁移能力的影响。裸鼠成瘤实验探究木犀草素对裸鼠体内瘤体的瘤重、瘤体积的影响。结果:木犀草素以时间浓度依赖性抑制胶质瘤U87及U251细胞活性。划痕实验及Transwell实验显示,木犀草素处理组较对照组细胞侵袭迁移能力降低(P<0.05)。木犀草素处理使胶质瘤细胞由间充质形态向上皮细胞形态转变。与对照组相比,木犀草素组N-cadherin、Vimentin、β-catenin(胞浆、胞核)、p-GSK-3β(Ser9)等蛋白水平降低,而E-cadherin蛋白水平上升(P<0.05)。GO6983处理可加强木犀草素对上皮间质转化及GSK-3β/β-catenin信号通路的影响;LiCl处理可逆转木犀草素对上皮间质转化、GSK-3β/β-catenin信号通路及侵袭迁移能力的影响。体内实验显示,木犀草素治疗组瘤体体积、瘤体质量较对照组降低(P<0.05)。结论:木犀草素可以抑制胶质瘤U87及U251细胞侵袭和迁移,其机制可能是通过调节GSK-3β/β-catenin信号通路而抑制EMT过程。

CK2α通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路调控肺腺癌A549细胞的侵袭及迁移

背景与目的肺癌已成为全球癌症死亡的首要原因,而侵袭和转移是导致肿瘤死亡的主要原因之一,蛋白激酶CK2是一种高度保守信使非依赖性丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,其在各种肿瘤中高表达。本研究旨在探讨下调CK2α基因表达对肺腺癌A549细胞侵袭迁移的影响以及可能的机制。方法构建p SilencerTM4.1-sh CK2α-e GFP慢病毒表达载体,建立稳定干扰CK2α表达的A549细胞株。利用Transwell和Boyden小室实验检测干扰CK2α表达前后A549细胞的侵袭及迁移的能力。Western blot检测PI3K/Akt信号通路和上皮-间充质转化(mesenchymal-to-epithelial transition,EMT)相关蛋白的表达。结果与对照组相比,干扰CK2α表达后肺腺癌A549细胞的侵袭及迁移能力明显下降,p-PTEN、Akt、p-Akt473、p-Akt308、p-PDK1、p-c-Raf、p-GSK-3β蛋白明显下调,PTEN蛋白表达水平显著上调。上皮-间充质转化的相关蛋白E-cadherin蛋白表达水平显著上调,而Vimentin、β-catenin、Snail蛋白表达水平显著下调,与侵袭转移相关蛋白的MMP2、MMP9表达水平显著下调。结论 CK2α可能通过PI3K/Akt/GSK-3β/Snail信号通路来调控上皮-间充质转化参与肺腺癌A549细胞的侵袭及迁移。

白皮杉醇调控GSK-3β/Nrf2信号通路减轻神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤

目的:阐明白皮杉醇对抗脑缺血再灌注损伤的作用及机制。方法:构建氧糖剥夺再灌注(OGD/R)神经细胞模型,于氧糖剥夺2 h后给予白皮杉醇处理细胞24 h,采用MTT法检测细胞存活率,细胞内乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞损伤程度,比色法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和三磷酸腺苷(ATP)含量,流式细胞术和倒置荧光显微镜检测细胞活性氧水平,透射电子显微镜观察神经细胞线粒体超微结构,JC-1探针法检测线粒体膜电位,蛋白质印迹法检测蛋白激酶B(AKT)与糖原合成酶激酶(GSK)-3β的磷酸化水平,免疫荧光染色法观测细胞核转录因子红系2相关因子(Nrf)2核定位。采用上述方法观察Nrf2抑制剂ML385预处理24 h对白皮杉醇改善OGD/R神经细胞活性、抗氧化性作用的影响,并采用蛋白质印迹法检测Nrf2、血红素加氧酶1、醌氧化还原酶1的表达水平。结果:白皮杉醇可以显著提高OGD/R神经细胞存活率、减少LDH释放和活性氧水平、提高SOD活性、改善线粒体超微结构损伤、提高线粒体膜电位和ATP水平(均P<0.05),增强AKT与GSK-3β蛋白的磷酸化水平,上调Nrf2、血红素加氧酶1、醌氧化还原酶1蛋白表达,提高细胞Nrf2的核浆比,促进Nrf2核转入(均P<0.05);而ML385可以显著逆转白皮杉醇对模型细胞的挽救作用及对SOD、活性氧和LDH的调节活性(均P<0.05)。结论:白皮杉醇可通过激活GSK-3β,靶向调控Nrf2,促进其核转入,发挥相应抗氧化效应,并保护线粒体结构与功能。

青蒿琥酯对人源肝星状细胞中Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路的影响研究

目的:探讨青蒿琥酯(Art)对Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路的影响。方法:不同浓度(0,12.5,25,50μg·ml^(-1))Art作用于人源肝星状细胞(LX-2),采用CCK-8法检测细胞增殖情况,并确定给药浓度;给予不同浓度Akt抑制药MK-2206 0~8μmol·L^(-1),Western blot法确定其最佳抑制浓度;给予Art、MK-2206、MK-2206+Art,采用Western blot法检测各组Akt、pAkt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达情况。结果:CCK-8法检测细胞存活率,当选用25μg·ml^(-1)Art作用于LX-2细胞24h时细胞存活率约80%,Western blot法确定当MK-2206浓度为6μmol·L^(-1)时,可有效抑制p-Akt的表达;Art组(25μg·ml^(-1))、MK-2206组(6μmol·L^(-1))、MK-2206(6μmol·L^(-1))+Art(25μg·ml^(-1))组与对照组相比,Akt、p-Akt、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达均有显著差异(P<0.05),MK-2206(6μmol·L^(-1))+Art(25μg·ml^(-1))组分别与Art(25μg·ml^(-1))组、MK-2206(6μmol·L^(-1))组比较,GSK-3β、Akt蛋白表达无显著差异(P>0.05),p-Akt、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:Art可通过Akt因子对Wnt/β-catenin信号通路中相关因子产生影响,进而抑制细胞增殖,缓解肝纤维发展进程。

异橙黄酮通过AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路诱导胃癌AGS细胞凋亡和周期阻滞研究

目的:探讨异橙黄酮对胃癌细胞AGS增殖、凋亡和周期的影响及相关作用机制。方法:用2.5,5和10μmol·L^(-1);的异橙黄酮处理胃癌AGS细胞,另设阴性对照组,加入等体积的DMSO。应用CCK-8、EDU和流式细胞数检测各组AGS细胞增殖、凋亡和周期情况;分子对接技术明确异橙黄酮的可能作用靶点;Western blot检测各组AGS细胞中蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化糖原合酶激酶3β(9号丝氨酸位点)[p-GSK-3β(ser9)]、β-连环蛋白(β-catenin)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X调控因子(Bax)、半胱天冬酶-8剪切体(cleave-caspase-8)、周期素依赖性激酶4(CDK4)和周期素依赖性激酶6(CDK6)的表达。以10μmol·L^(-1);的异橙黄酮、10μmol·L^(-1);的异橙黄酮联合10μmol·L^(-1);AKT激动剂SC79以及等体积的DMSO(对照)处理胃癌AGS细胞,应用Western blot检测AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β(ser9)和β-catenin的表达,以及应用CCK-8、EDU和流式细胞数检测各组AGS细胞增殖、凋亡和周期情况。结果:与阴性对照组相比,2.5,5和10μmol·L^(-1);异橙黄酮处理组AGS细胞增殖均明显减弱,凋亡率均明显增加,显著阻滞在G1期(P<0.05或P<0.01),异橙黄酮能与AKT的活性口袋稳定结合,显著减少胃癌AGS细胞中p-AKT、p-GSK-3β(ser9)、β-catenin、Bcl-2、CDK4和CDK6的表达以及增加Bax和cleave-caspase-8的表达(P<0.05或P<0.01)。与10μmol·L^(-1);的异橙黄酮处理组相比,10μmol·L^(-1);的异橙黄酮联合10μmol·L^(-1);的AKT激动剂SC79处理组细胞p-AKT、p-GSK-3β(ser9)和β-catenin的表达显著增加,细胞增殖率明显增加,凋亡率明显减少,且G1期细胞阻滞程度明显减弱(P<0.05或P<0.01)。结论:异橙黄酮可能通过AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路抑制AGS细胞的增殖以及诱导其凋亡和周期阻滞。

基于DKK3调控探讨藏红花素对Aβ25-35诱导神经元损伤的保护作用

目的:探究藏红花素通过调控dickkopf WNT信号通路抑制因子3 (Dickkopf3,DKK3)对Aβ25-35诱导神经细胞损伤的保护作用及机制。方法:Aβ25-35诱导小鼠海马神经细胞系HT22细胞模拟细胞损伤,CCK8增殖实验检测藏红花素最佳干预浓度。qPCR检测DKK3沉默质粒(DKK3 siRNA)以及DKK3过表达质粒(DKK3-OE)的DKK3 mRNA表达,随后进行细胞转染。细胞分为正常组、Aβ25-35组、Aβ25-35+藏红花素组(1.0μmol/L)、Aβ25-35+DKK3 siRNA组、Aβ25-35+siRNA对照组、DKK3-OE组、空白质粒对照组、DKK3-OE+藏红花素组(1.0μmol/L)组。采用流式细胞数检测细胞凋亡,Tubulin β染色观察细胞神经突触形态,Western blot检测细胞Aβ、DKK3、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果:0.5~2.0μmol/L藏红花素可显著上调HT22细胞活力(P<0.05)。与正常组相比,Aβ25-35组和DKK3-OE组细胞凋亡显著增加,突触长度、分支数显著减少,Aβ、DKK3、p-GSK-3β/GSK-3β、Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高,β-catenin、Bcl-2蛋白蛋白表达显著降低(P<0.01)。与DKK3-OE组相比,藏红花素干预则能逆转以上结果。与Aβ25-35组相比,Aβ25-35+藏红花素组和Aβ25-35+DKK3 siRNA组细胞的凋亡显著降低,突触长度、分支数显著增加,Aβ、DKK3、p-GSK-3β/GSK-3β、Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低,β-catenin、Bcl-2蛋白蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:藏红花素对Aβ25-35诱导神经细胞损伤具有保护作用,其作用与通过抑制DKK3调控GSK-3β/β-catenin信号通路表达有关。

基于PI3K/Akt/GSK-3β信号通路探讨益智治呆方对AD模型大鼠学习记忆能力的影响及其作用机制

目的:观察益智治呆方对阿尔茨海默病(AD)大鼠学习记忆能力的影响,探讨其促进认知功能恢复的作用机制。方法:将50只大鼠随机分为假手术组10只和手术组40只,手术组建立AD大鼠模型后随机分为模型组、治疗组、对照组。术后第10天开始定时灌胃给药,治疗第28天行Y形迷宫检测学习记忆能力,采用免疫组织化学方法观察海马中央注射区β-淀粉样蛋白(Aβ)的表达情况;应用TUNEL试剂盒检测海马中央注射区神经细胞的凋亡情况;采用Western blotting检测PI3K、t-Akt、p-Akt、t-GSK-3β、p-GSK-3β、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平。结果:益智治呆方、多奈哌齐均能改善AD大鼠学习记忆能力(P<0.05);与模型组比较,治疗组和对照组海马中央注射区β-淀粉样蛋白表达、凋亡细胞率明显减少(P<0.05),PI3K、p-Akt、p-GSK-3β、Bcl-2等抗凋亡蛋白表达增多(P<0.05),t-GSK-3β、Bax等促凋亡蛋白表达减少(P<0.05);治疗组上述指标与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:益智治呆方能够有效改善AD模型大鼠学习记忆能力,降低Aβ神经毒性,减少神经元细胞凋亡,其机制可能是通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路调控凋亡蛋白表达。

GPC3通过活化Wnt/β-catenin通路促进HepG2生长

目的分析GPC3是否活化Wnt/β-catenin信号通路从而促进肝癌细胞HepG2的生长,以期为进一步基于GPC3的肝癌基因免疫治疗提供依据。方法用携带GPC3基因的质粒转染肝癌细胞HepG2,运用Western blotting检测Wnt/β-catenin信号通路中关键分子和靶基因的表达,判定Wnt/β-catenin信号通路的活化情况,并采用MTT实验对比转染前后HepG2的增殖率。结果GPC3转染过表达的HepG2较未转染组其Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-catenin和靶基因c-myc、cyclin D1的表达明显上升,且转染后24、48、72 h MTT实验表明转染组HepG2细胞增殖较未转染组加快(P<0.05)。结论 GPC3促进肝癌细胞HepG2的生长很可能通过过度活化Wnt/β-catenin信号通路实现。

糖尿病溃疡中Wnt/β-catenin信号通路表达的变化

目的:观察糖尿病(DM)溃疡中Wnt/β-catenin信号通路表达的变化,探讨该信号通路在糖尿病难愈性溃疡中的作用。方法:雌性Wistar大鼠采用高脂高糖饲料联合小剂量链脲佐菌素液腹腔注射法制备糖尿病模型。分别取正常对照组与DM组制作溃疡模型。观察创面造模后第3天、第7天和第14天对照组及DM组创面愈合情况的变化,并采用HE染色法检测创面组织形态结构的变化,采用ELISA法和RT-PCR法检测创面组织中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白及mRNA的变化。结果:DM组大鼠的创面愈合率明显低于对照组(P<0.05),且与对照组相比,其创面组织中含有较少的炎性细胞、纤维母细胞及新生毛细血管。DM组大鼠创面组织中β-catenin和Rspo-3蛋白及mRNA的表达水平均低于对照组,GSK-3β蛋白及mRNA的表达水平均高于对照组(P<0.05)。结论:Wnt/β-catenin通路的下调有可能导致了糖尿病溃疡的难愈,而该通路的下调可能源自于Rspo-3蛋白表达的下降。

祛腐生肌外治法对糖尿病溃疡大鼠血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其相关信号通路影响的meta分析和系统评价

目的:系统评价中药外用祛腐生肌法对糖尿足溃疡(DFU)大鼠模型血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其相关信号通路的影响并进行Meta分析。方法:在中国知网、万方、PubMed等数据库进行文献检索,检索时间自建库至2022年4月。根据SYRCLE的偏倚风险工具对每一篇纳入文献的研究质量进行评价。使用Review Manager 5.4.1软件根据Cochrane系统评价方法进行Meta分析。结果:包括508只大鼠的19项研究,纳入研究的质量分数都在3~5分。Meta分析结果显示,无论是促进糖尿病溃疡大鼠创面组织中VEGF蛋白表达、增加创面组织中VEGF mRNA水平还是提高大鼠血清中VEFG因子含量,与对照组相比,祛腐生肌治疗组都具有明显的优势[SMD=1.39,95%CI(0.67,2.10),P=0.0002;SMD=5.53,95%CI(0.58,10.11),P=0.03;SMD=1.91,95%CI(0.73,3.09),P=0.002]。亚组分析显示,当对照组为常规换药组时,中药外用促进创面组织中VEGF蛋白表达的优势明显[SMD=2.02,95%CI(1.27,2.78),P=0.0002;SMD=2.06,95%CI(0.16,3.96),P=0.03],当对照组为生长因子换药组时,尚不能证明二者在促进创面组织中VEGF蛋白表达方面有差异[SMD=0.04,95%CI(-0.52,0.61),P=0.88]。同时研究表明,中药外用可能是通过调控HIF-1/VEGF/VEGFR-2信号通路、PI3K/AKT信号通路、Wnt/β-catenin信号通路中的上下游分子的表达,从而影响尿病溃疡大鼠创面组织及血清中VEGF的表达水平,这些分子包括HIF-1α[SMD=2.35,95%CI(1.11,3.59),P=0.0002]、VEGFR-2[SMD=4.52,95%CI(0.63,8.42),P=0.02]、PI3K[SMD=-0.94,95%CI(-1.08,-0.80),P=0.00001]、AKT[SMD=0.28,95%CI(0.22,0.34),P<0.00001]、β-catenin[SMD=0.23,95%CI(0.19,0.27),P<0.00001]、GS3K-β[SMD=0.44,95%CI(0.06,0.82),P=0.02]、Cym-c[SMD=-0.47,95%CI(-0.72,-0.22),P=0.0002]。结论:中药外用祛腐生肌法治疗DFU大鼠创面与其促进VEGF在创面和血清中的表达相关,其机理可能与影响HIF-1α/VEGF/VEGFR-2、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT等信号通路的上下游分子有关,但仍需更多的大样本、高治疗、设计更合理的实验来进一步验证。

特发性肺纤维化发生发展过程中miR-29的作用及上下游信号通路研究进展

小分子RNA(miRNA)是一类由18~25个核苷酸构成的功能性非编码RNA,主要参与转录后基因水平的调控。miR-29是一类与纤维化密切相关的miRNA。动物实验证实,抑制特发性肺纤维化动物肺组织miR-29表达可以促进特发性肺纤维化的发生。特发性纤维化患者肺组织中miR-29各亚型表达均下降。miR-29通过对转化生长因子β(TGF-β)/Smad3、蛋白磷酸酶2A(PP2A)/组蛋白脱乙酰酶C4(HDAC4)、Wnt/β-catenin、PI3K-AKT、Fas死亡受体途径等多条信号通路的调节,进而抑制细胞外基质合成和分泌,参与特发性肺纤维化发生发展过程。