人参皂苷Rh2通过调控GSK-3β/Wnt双信号通路影响骨肉瘤细胞增殖和凋亡

目的:探讨人参皂苷Rh2(Rh2)对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,并进一步研究Rh2在骨肉瘤中抗肿瘤作用的机制。方法:分别以不同浓度的Rh2处理骨肉瘤细胞,用MTT法检测骨肉瘤细胞活性的变化;用基质凝胶(Matrigel)侵袭和孔膜法(Transwell)迁移实验检测骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力的变化;用Annexin V-FITC/PI调亡检测试剂盒及流式细胞仪检测骨肉瘤细胞的调亡变化;用Western blot法检测细胞侵袭、凋亡相关蛋白的表达情况。结果:骨肉瘤细胞经过不同浓度的Rh2处理后,MTT实验结果表明Rh2在一定浓度范围内可以显著抑制骨肉瘤细胞的生长(P<0.05)。Matrigel侵袭和Transwell迁移实验结果表明Rh2可以有效抑制骨肉瘤细胞的侵袭与迁移(P<0.05)。Annexinv-FITC/PI凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测结果表明,Rh2可以促进骨肉瘤细胞的凋亡反应(P<0.05)。Western blot实验结果则显示Rh2可以上调Bax、E-cadherin蛋白的表达,并抑制Bcl-2、PARP、MMP2、MMP9蛋白的表达。Rh2还可以通过激活GSK-3β并抑制β-catenin、Cyclin D1和C-myc相关蛋白来达到调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭反应的作用。结论:Rh2可以抑制骨肉瘤细胞的增殖并诱导其凋亡,这种作用可能是通过激活GSK-3β并抑制Wnt/β-catenin信号通路来实现的。

温阳消癥方通过抑制Wnt3α/β-catenin/GSK-3β通路减轻5/6肾切除小鼠肾纤维化

目的:探讨温阳消癥方在5/6肾切除小鼠肾纤维化中的疗效及可能的作用机理。方法:40只C57BL/6小鼠随机选取10只作为假手术组,另取30只小鼠,制作5/6肾切除模型,判断造模成功后,随机将其分为模型组、罗沙司他组和温阳消癥组各10只。用药8周后用Western blot测定各组小鼠肾组织中Wnt3a和β-连环蛋白含量(β-catenin)、糖合成酶激酶-3β(GSK-3β)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)表达水平,用RT-qPCR法检测各组小鼠肾组织中Wnt3a、GSK-3β和β-catenin mRNA的水平。结果:治疗8周后,模型组小鼠肾组织Wnt3a、β-catenin、GSK-3β、ColⅠ、ColⅢ、α-SMA与假手术组相比蛋白的表达量增加(P<0.01),模型组小鼠肾组织Wnt3a、GSK-3β、β-catenin mRNA较假手术组表达增加(P<0.01);罗沙司他组、温阳消癥组相对于模型组Wnt3a、β-catenin、GSK-3β、ColⅠ、ColⅢ、α-SMA蛋白表达和Wnt3a、GSK-3β、β-catenin mRNA表达均降低(P<0.01);和罗沙司他组相比,温阳消癥组Wnt3a、β-catenin、GSK-3β蛋白的表达降低(P<0.01)。结论:温阳消方对Wnt3α-β-catenin-GSK-3β信号转导途径的抑制作用可能降低了5/6肾切除大鼠肾纤维化的病灶范围。

SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1 accelerates diabetic macular edema progression by WNT inhibitory factor 1

BACKGROUND Diabetic macular edema(DME)is the most common cause of vision loss in people with diabetes.Tight junction disruption of the retinal pigment epithelium(RPE)cells has been reported to induce DME development.SMAD-specific E3 ubiquitin protein ligase(SMURF)1 was associated with the tight junctions of cells.However,the mechanism of SMURF1 in the DME process remains unclear.AIM To investigate the role of SMURF1 in RPE cell tight junction during DME.METHODS ARPE-19 cells treated with high glucose(HG)and desferrioxamine mesylate(DFX)for establishment of the DME cell model.DME mice models were constructed by streptozotocin induction.The trans-epithelial electrical resistance and permeability of RPE cells were analyzed.The expressions of tight junction-related and autophagy-related proteins were determined.The interaction between insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 2(IGF2BP2)and SMURF1 mRNA was verified by RNA immunoprecipitation(RIP).SMURF1 N6-methyladenosine(m6A)level was detected by methylated RIP.RESULTS SMURF1 and vascular endothelial growth factor(VEGF)were upregulated in DME.SMURF1 knockdown reduced HG/DFX-induced autophagy,which protected RPE cell tight junctions and ameliorated retinal damage in DME mice.SMURF1 activated the Wnt/β-catenin-VEGF signaling pathway by promoting WNT inhibitory factor(WIF)1 ubiquitination and degradation.IGF2BP2 upregulated SMURF1 expression in an m6A modification-dependent manner.CONCLUSION M6A-modified SMURF1 promoted WIF1 ubiquitination and degradation,which activated autophagy to inhibit RPE cell tight junctions,ultimately promoting DME progression.

lncRNA ENST00000452996.1通过ERK/GSK-3β/β-catenin信号通路调控肝癌细胞增殖、迁移及侵袭

目的研究一种新的长链非编码RNA ENST00000452996.1对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭等的影响及其调控机制。方法TCGA数据集分析肝癌组织ENST00000452996.1表达;构建ENST00000452996.1的shRNA载体,包装病毒感染Huh-7细胞(shENST00000452996.1组),CCK-8法、克隆形成法、流式细胞术、划痕法和Transwell小室法分别检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力;Western blot法检测shENST00000452996.1组、ERK激动剂EGF处理组和GSK-3β抑制剂TDZD-8处理组的ERK/GSK-3β/β-catenin信号分子的表达。结果TCGA分析发现,肝癌组织ENST00000452996.1表达水平明显高于癌旁组织,且与Edmondson-Steiner分级呈正相关,与总生存时间呈负相关;与对照组相比,shENST00000452996.1组细胞增殖、迁移及侵袭能力明显下降,凋亡能力明显增强,p-ERK1/2、p-GSK-3β^(Ser9)和β-catenin表达均下调,GSK-3β和p-β-catenin表达上调,核β-catenin表达下降;与shENST00000452996.1组相比,EGF处理组p-ERK1/2表达升高,EGF处理组和TDZD-8处理组p-GSK-3β^(Ser9)和β-catenin及核β-catenin表达均升高,GSK-3β和p-β-catenin表达均降低。结论干扰ENST00000452996.1表达抑制ERK1/2磷酸化,阻止GSK3β^(Ser9)磷酸化,导致β-catenin磷酸化,抑制β-catenin核转位,推断ENST00000452996.1通过ERK/GSK-3β/β-catenin信号通路增强肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,抑制细胞凋亡,从而发挥促进肝细胞癌的作用。

补中益气汤含药血清调控GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路增强A549细胞对顺铂敏感性的研究

目的:探讨补中益气汤含药血清增强A549细胞对顺铂敏感性的机制是否与GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路有关。方法:制备补中益气汤含药血清作用于A549细胞株,随机分为a组(对照血清组)、b组(顺铂组)、c组(补中益气汤组)、d组(补中益气汤含药血清联合顺铂组)。流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测GSK-3β、p-GSK-3β^(ser9)、p-GSK-3β^(tyr216)、β-catenin、survivin蛋白表达。结果:补中益气汤含药血清联合顺铂可降低p-GSK-3β^(ser9)、β-catenin、survivin蛋白表达,提高晚期细胞凋亡率。结论:抑制GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路激活可能是补中益气汤含药血清增强A549细胞对顺铂敏感性的作用机制之一。

敲低趋化因子受体3通过减弱Wnt/β-catenin信号通路抑制肝母细胞瘤细胞增殖与迁移

目的 探讨CXC趋化因子受体3 (CXC chemokine receptor 3,CXCR3)在肝母细胞瘤(hepatoblastoma,HB)中的作用及机制。方法 收集16例HB组织及其癌旁组织,用免疫组化与Western blot法检测CXCR3蛋白的表达。HB细胞(Huh-6及HepT1)分别转染Con-shRNA、CXCR3-shRNA1和CXCR3-shRNA2后,将其分为Con-shRNA组、CXCR3-shRNA1组和CXCR3-shRNA2组。CCK-8法和EdU染色法检测细胞增殖,划痕法和Transwell法检测细胞迁移与侵袭,Western blot法检测β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc、细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)、基质金属蛋白酶(metallomatrix proteinase,MMP)7及MMP-9的表达。裸鼠异位移植;肿瘤实验检测各组细胞体内成瘤情况及瘤体体积,并用免疫组化检测瘤体组织中MMP-9和Ki67表达。结果 CXCR3在HB组织中表达上调(P<0.01)。与Con-shRNA比较,CXCR3-shRNA1组和CXCR3-shRNA2组Huh-6及HepT1细胞活力、增殖、迁移及侵袭能力均降低(P<0.01),Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达减弱(P<0.01),细胞移植瘤的瘤体生长缓慢且体积明显缩小(P<0.01),瘤体组织中MMP-9和Ki67表达降低(P<0.01)。结论 下调CXCR3可抑制HB细胞的增殖与迁移,其机制可能与减弱Wnt/β-catenin信号有关。

不同中药调控Wnt/GSK-3β/β-连环素蛋白通路治疗骨质疏松症的研究现状

Wnt/GSK-3β/β-连环素蛋白(β-catenin)通路是一种作用广泛的经典信号通路,在骨骼生长发育及骨髓干细胞转化等多种过程起重要作用。笔者就不同中药通过该通路对骨重建影响的文献研究,了解到苦味药独活、藜芦、姜黄、黄连、黄芩,补肾药龟板、淫羊藿、骨碎补,补气药黄芪等单味中药及左归丸、右归丸、金贵肾气丸等补肾中药复方通过调控Wnt/GSK-3β/β-catenin通路,抑制GSK-3β的表达,促使更多的β-catenin向核内转移,进而诱导骨髓干细胞向成骨细胞分化,抑制破骨,以达到增加骨密度、增强骨的机械应力、治疗骨质疏松的作用效果,通过观察中药对Wnt/GSK-3β/β-catenin通路各种蛋白表达的影响,阐明中药对骨代谢的调节作用,为开展中药复方治疗骨质疏松症的研究与开发提供思路。

六味地黄汤对快速衰老小鼠认知功能及Wnt3a、GSK-3β表达的影响

目的研究六味地黄汤对D-半乳糖(D-gal)致快速衰老小鼠认知功能及Wnt3a、GSK-3β表达的影响。方法以500 mg/(kg·d)的D-半乳糖颈部皮下注射复制快速衰老小鼠模型,将动物随机分为正常组,模型组,六味地黄(简称六味)高、中、低剂量组,Vit E组,给予相应干预,历时8周。观察小鼠的体质量变化,采用Morris水迷宫实验评价小鼠的认知功能,免疫组化法、RT-q PCR法检测Wnt3a、GSK-3β的表达。结果六味地黄汤对快速衰老小鼠体质量及水迷宫实验的影响:模型组与正常组比较,差异具有显著统计学意义(P<0.01);各用药组与模型组比较,差异具有显著统计学意义(P<0.01);六味高剂量组与其他用药组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);六味地黄汤对快速衰老小鼠认知功能及Wnt3a、GSK-3β表达的影响:模型组与正常组比较,差异具有显著统计学意义(P<0.01),各用药组与模型组比较,差异具有显著统计学意义(P<0.01),六味高剂量组与其他用药组比较,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。结论六味地黄汤可以有效改善D-半乳糖致快速衰老小鼠的学习记忆障碍;增加衰老小鼠Wnt3a的表达,激活Wnt信号通路,下调GSK-3β的表达可能是六味地黄汤延缓衰老健脑益智的作用机制。

Wnt通路信号蛋白β-catenin和GSK-3β在孤独症模型大鼠脑中表达的变化

为探讨Wnt信号通路在孤独症发病中的作用,我们检测了Wnt信号通路中的两个关键信号蛋白分子β-catenin和GSK-3β在不同年龄阶段孤独症模型大鼠前额叶皮层,海马及小脑中的表达,同时对小脑进行了GSK-3β免疫组织化学染色检测。结果显示:孤独症模型动物的上述三个关键脑区内,β-catenin的表达水平显著升高,而GSK-3β的表达水平则明显降低;小脑内GSK-3β免疫反应阳性Purkinje细胞也明显减少。这些结果表明,孤独症模型大鼠脑内的Wnt信号通路信号传导亢进,而亢进的结果可能正是导致已知的孤独症脑内神经元发育异常的原因之一。由此提示:Wnt信号通路在孤独症的发病中起重要作用。

电针对颈椎病模型大鼠椎间盘细胞Wnt1、GSK-3β蛋白的影响

目的观察电针"大椎穴"对颈椎病模型大鼠椎间盘纤维环细胞Wnt1蛋白、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的影响,并初步探讨电针对颈椎间盘退变调控及抑制纤维环细胞凋亡的机制。方法选用SPF级SD大鼠40只,随机分成空白组、模型组、电针组、美洛昔康组,采用Western blot法检测颈椎间盘的纤维环细胞Wnt1、GSK-3β蛋白的表达水平的改变。结果模型组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05);电针组、美洛昔康组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。电针可增加颈椎间盘纤维环细胞的阳性表达,显著上调Wnt1、GSK-3β蛋白表达的水平。结论电针"大椎穴"可能是通过调节经典的Wnt/β-catenin信号通路中关键因子Wnt1蛋白、GSK-3β蛋白的表达来抑制颈椎病模型大鼠的椎间盘纤维环细胞凋亡。

WNT3A结合并稳定FZD2激活Wnt通路促进成骨细胞增殖和分化的分子机制研究

目的:探讨配体WNT3A通过稳定和激活FZD2(Frizzled2)增加成骨细胞骨形成的活性及其分子机制。方法:24只雌性6~8周龄C57BL/6J小鼠随机分为4组,对照(Control)组,假手术(Sham)组,双侧卵巢摘除术(ovariectomy,OVX)诱导骨质疏松症(Osteoporosis,OP)小鼠模型组(OVX组),OVX+雌二醇治疗组(OVX+E2 Treatment组),每组6只小鼠。建立OVX小鼠模型。Western blot法测定小鼠后肢胫骨组织中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2以及磷酸化(p-)STAT3、STAT3、p-JAK2和JAK2的表达水平。CCK-8测定小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1的增殖能力。腺病毒-shRNA-FZD2介导敲低MC3T3-E1细胞中的FZD2。免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation,co-IP)法测定WNT3A处理MC3T3-E1细胞前后FZD2与泛素(ubiquitin,Ub)的直接结合情况。结果:与OVX组相比,OVX+E2 Treatment组小鼠胫骨组织中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表达水平均被上调(P<0.05)。与Control组相比,WNT3A Treatment组MC3T3-E1细胞中FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表达水平均升高(P<0.05);细胞增殖能力增强(P<0.05)。与WNT3A Treatment组相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2组FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表达水平均降低(P<0.05);p-STAT3和p-JAK2的磷酸化水平均降低(P<0.05);增殖能力降低(P<0.05);而2组细胞中STAT3和JAK2的表达水平无统计学差异(P>0.05)。在IP:Ub组中,与WNT3A处理(-)的细胞相比,WNT3A处理(+)的细胞中FZD2的表达水平升高(P<0.05)。结论:WNT3A的促骨合成代谢活性是通过结合并稳定FZD2激活Wnt/β-Catenin信号通路实现的。

骨疏方调节FoxO3a/Wnt信号通路对H_(2)O_(2)诱导成骨细胞损伤的影响

目的探讨骨疏方调节FoxO3a/Wnt信号通路对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导成骨细胞损伤的影响。方法CCK-8法检测不同浓度(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)的骨疏方对H_(2)O_(2)诱导的MC3T3-E1细胞活力。随后设置对照组、H_(2)O_(2)(150μmol/L H_(2)O_(2))组、骨疏方组、骨疏方+空载体组、骨疏方+FoxO3a过表达组。CCK-8法、ELISA分别检测细胞活力、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA);成骨诱导分化后,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒及茜素红分析ALP活性、细胞骨矿化结节;qRT-PCR检测成骨相关基因OPN mRNA、Runx2 mRNA以及FoxO3a mRNA表达水平;Western blot检测通路相关蛋白FoxO3a、Wnt2、β-连环蛋白(β-catenin)表达水平。结果与对照组比较,H_(2)O_(2)组MDA、FoxO3a表达显著增加,细胞活力、SOD、ALP活性、骨矿化结节数量、OPN mRNA、Runx2 mRNA、Wnt2、β-catenin表达显著降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,骨疏方组MDA、FoxO3a表达显著降低,细胞活力、SOD、ALP活性、骨矿化结节数量、OPN mRNA、Runx2 mRNA、Wnt2、β-catenin表达显著增加(P<0.05);与骨疏方+空载体组比较,骨疏方+FoxO3a过表达组MDA、FoxO3a表达显著增加,细胞活力、SOD、ALP活性、骨矿化结节数量、OPN mRNA、Runx2 mRNA、Wnt2、β-catenin表达显著降低(P<0.05)。结论骨疏方可改善H_(2)O_(2)诱导成骨细胞损伤,可能与抑制FoxO3a/Wnt信号通路有关。

Wnt信号通路中GSK-3β和CD44v6在人结直肠肿瘤组织中的表达及意义

目的探讨Wnt信号通路中GSK-3β、CD44v6在人结直肠肿瘤组织中的表达及其相关性。方法应用免疫组化Envision法测定GSK-3β和CD44v6在正常结直肠黏膜组(n=20),结直肠腺瘤组(n=19)和腺癌组(n=45)中的表达情况,分析GSK-3β和CD44v6在结直肠癌中的表达及与临床病理参数之间的关系及其相关性。结果 1GSK-3β在正常肠黏膜、结直肠腺瘤及结直肠癌三组中均表达,阳性表达率分别为5.0%(1/20),42.1%(8/19),77.8%(35/45)。癌组织中GSK-3β表达显著高于腺瘤组和正常黏膜组(P<0.05),GSK-3β表达与Dukes分期、分化程度、有无淋巴结转移均无关(P>0.05)。2CD44v6在癌组织中阳性表达率55.6%(25/45),在结直肠腺瘤及正常肠黏膜中阳性率为0,在癌组织中表达显著高于结直肠腺瘤组和正常黏膜组(P<0.05)。CD44v6的表达与Dukes分期、淋巴结转移相关(P<0.05),而与分化程度无关。3经Spearman秩相关分析,GSK-3β与CD44v6在结直肠癌中的表达无相关性(r=0.167,P>0.05)。结论 GSK-3β和CD44v6均参与了结直肠肿瘤的发生及发展,未来可能是判断肿瘤预后的标志。CD44v6在结直肠癌的浸润转移过程中可能起着重要的作用。

藏红花素通过PI3K/Akt/GSK-3β通路诱导人乳腺癌细胞凋亡的初步研究

目的:探讨藏红花素对人乳腺癌细胞凋亡的影响及相关调控机制。方法:以人正常乳腺MCF-10A细胞和人乳腺癌MCF-7细胞为受试细胞,分别以不同浓度藏红花素0(空白对照组)、200、400、800 mg/L和LY294002(PI3K特异性抑制剂)15 mg/L干预对数生长期MCF-10A细胞和MCF-7细胞48 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、克隆形成实验分别检测各组细胞增殖抑制率、细胞克隆能力,Annexin V-FITC染色法检测细胞凋亡水平,运用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶9(cysteine aspartic proteases-9,Caspase-9)、激活型半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶3(cleaved cysteine aspartate protease-3,Cleaved caspase-3)、B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(bcl-2 related X protein,Bax)蛋白表达。结果:与空白对照组比较,200、400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-10A细胞增殖抑制率、克隆数目、凋亡率,差异均无统计学意义(P>0.05);400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-7细胞增殖抑制率升高、克隆数目降低、凋亡率升高(P<0.01);p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β、Bcl-2表达下调且Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax表达上调(P<0.01),磷酸化率p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β降低(P<0.01),Bax/Bcl-2表达比值升高(P<0.01)。与LY294002组比较,800 mg/L藏红花素组MCF-7细胞增殖抑制率升高、克隆数目降低、凋亡率升高(P<0.05或P<0.01);Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax表达上调(P<0.05或P<0.01),Bax/Bcl-2比值升高(P<0.01),其他指标两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:藏红花素具有诱导人乳腺癌细胞凋亡的作用,其机制可能与抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路有关。

基于Wnt/β-连环蛋白通路探究金天格对肿瘤坏死因子-α诱导的小鼠MC3T3E1细胞生物学功能的影响实验研究

目的:探讨金天格通过调节Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)通路对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的小鼠成骨细胞(MC3T3E1)细胞生物学功能的影响。方法:体外培养MC3T3E1细胞,分为对照组、TNF-α组(50 ng/ml TNF-α)、L-金天格组(50 ng/ml TNF-α+10^(-6) g/L金天格)、M-金天格组(50 ng/ml TNF-α+10-5 g/L金天格)、H-金天格组(50 ng/ml TNF-α+10^(-4) g/L金天格)、Dickkopf-1(DKK-1)组(50 ng/ml TNF-α+10 ng/ml Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK-1)、H-金天格+LiCl组(50 ng/ml TNF-α+10^(-4) g/L金天格+20μmol/L Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl)。用CCK-8试剂盒对细胞活性进行检测,用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测,用酶联免疫吸附试验对细胞白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6水平进行检测,用Western blot对细胞凋亡相关蛋白及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达情况进行检测。结果:与对照组比较,TNF-α组细胞活性、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、细胞程序性死亡配体-1(PD-L1)蛋白表达降低,细胞凋亡率、IL-1β、IL-6水平以及B细胞淋巴瘤(Bax)、β-catenin、转录因子7样2(TCF7L2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)蛋白表达升高(均P<0.05)。与TNF-α组比较,L-金天格组、M-金天格组、H-金天格组、DKK-1组细胞活性及Bcl-2、PD-L1蛋白表达升高,细胞凋亡率、IL-1β、IL-6水平以及Bax、β-catenin、TCF7L2、Cyclin D1蛋白表达降低(均P<0.05)。与H-金天格组比较,H-金天格+LiCl组细胞活性及Bcl-2、PD-L1蛋白表达降低,细胞凋亡率、IL-1β、IL-6水平以及Bax、β-catenin、TCF7L2、Cyclin D1蛋白表达升高(均P<0.05)。结论:金天格可能通过抑制Wnt/β-catenin通路减轻TNF-α诱导的MC3T3E1细胞损伤。

中药复方金思维含药血清调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路对拟阿尔茨海默病细胞模型tau蛋白磷酸化的影响

目的探讨中药复方金思维含药血清对拟阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)细胞模型tau蛋白磷酸化的影响及作用机制。方法采用Aβ25-35诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)建立拟AD细胞模型,CCK-8法筛选金思维含药血清、PI3K/AKT/GSK-3β通路抑制剂LY294002最佳作用浓度。将SH-SY5Y细胞分为正常组、模型组、金思维低剂量组、金思维中剂量组、金思维高剂量组以及LY294002组。蛋白免疫印迹法检测金思维含药血清对SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化以及PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白的影响。结果20μmol/L Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞24 h可建立最佳拟AD细胞模型。相对于正常组,模型组P-AKT显著降低(P<0.05),P-tau显著升高(P<0.01)。相对于模型组,金思维低剂量含药血清组PI3K的表达量显著升高(P<0.05),高剂量含药血清组GSK-3β的表达量显著降低(P<0.05),中剂量和高剂量含药血清组P-tau的表达量显著降低(P<0.01、P<0.001)。加入通路抑制剂LY294002后,P-PI3K、PI3K、P-AKT、AKT、GSK-3β、P-tau蛋白的表达量较模型组差异无统计学意义(P>0.05)。结论金思维含药血清可降低拟AD细胞模型tau蛋白磷酸化水平,其机制可能与PI3K/AKT/GSK-3β通路的激活有关。

化瘀消痞汤对大鼠萎缩性胃炎癌前病变及PI3K/Akt/GSK-3β通路的影响

目的探讨化瘀消痞汤对大鼠萎缩性胃炎癌前病变的作用以及对PI3K/Akt/GSK-3β通路的影响。方法60只SPF级SD雄鼠随机挑选10只为空白组,其余大鼠采用多因素造模法制备萎缩性胃炎癌前病变模型。造模成功后随机分为模型组,化瘀消痞汤高、中、低剂量组(24.8、12.4、6.2 g/kg),叶酸组(2 mg/kg),每组10只,连续给药90 d。造模及给药期间观察大鼠一般状况、记录体质量及3 h进食量;HE染色观察大鼠胃组织形态变化;ELISA法检测大鼠胃组织匀浆液Cyclin D1、c-Myc水平;免疫荧光法检测大鼠胃组织Ki67蛋白表达;Western blot法检测大鼠胃组织PI3K、p-Akt、p-GSK-3β、β-catenin、CDK4蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠萎靡倦怠,体质量、3 h进食量降低(P<0.05),胃黏膜明显变薄,腺体数量明显减少且排列紊乱,肠上皮化生明显,胃组织匀浆液Cyclin D1、c-Myc水平升高(P<0.05),胃组织Ki67、PI3K、p-Akt、β-catenin、CDK4蛋白表达升高(P<0.05),p-GSK-3β蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠一般状况有所好转,体质量、3 h进食量增加(P<0.05),胃黏膜修复,腺体数量增多且排列趋于整齐,肠上皮化生减轻,胃组织匀浆液Cyclin D1、c-Myc水平降低,胃组织Ki67、PI3K、p-Akt、β-catenin、CDK4蛋白表达降低,p-GSK-3β蛋白表达升高,以化瘀消痞汤高、中剂量组更明显(P<0.05);与叶酸组比较,化瘀消痞汤高、中剂量组体质量、3 h进食量增加(P<0.05),胃黏膜形态和腺体数量逐渐趋于正常,胃组织匀浆液Cyclin D1、c-Myc水平降低(P<0.05),胃组织Ki67、PI3K、p-Akt、β-catenin、CDK4蛋白表达降低(P<0.05),高剂量组大鼠胃组织p-GSK-3β蛋白表达升高(P<0.05)。结论化瘀消痞汤可抑制萎缩性胃炎癌前病变大鼠胃上皮细胞异常增殖,改善胃黏膜损伤,其机制可能与调控PI3K/Akt/GSK-3β信号通路中关键因子表达有关。

山奈酚调节AKT/GSK-3β/Snail信号通路对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的:探讨山奈酚对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响,并探究其作用机制。方法:将CNE-2细胞分为对照组、山奈酚低浓度组、山奈酚中浓度组、山奈酚高浓度组、山奈酚高浓度+SC-79(AKT激活剂)组。CCK-8法和克隆实验测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测各蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、波形蛋白(Vimentin)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化Akt(p-AKT)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、Snail的表达水平。构建鼻咽癌裸鼠模型,分为裸鼠NC组、山奈酚组、山奈酚+SC-79组,测量肿瘤质量与体积,免疫组化法检测移植瘤组织p-AKT、p-GSK-3β、Snail蛋白表达。结果:山奈酚对人鼻咽癌上皮细胞活力无显著影响(P>0.05);鼻咽癌细胞活力随着山奈酚浓度的升高而逐渐降低(P<0.05),选择CNE-2作为后续实验细胞,选择25、50、100μmol/L山奈酚作为后续实验浓度。与对照组相比,山奈酚低、中、高组细胞活力、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、Snail水平显著下降,凋亡率、Bax、Caspase-3、E-cadherin上升(P<0.05);与山奈酚高浓度组相比,山奈酚高浓度+SC-79组细胞活力、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、Snail水平显著上升,凋亡率、Bax、Caspase-3、E-cadherin下降(P<0.05)。山奈酚能抑制移植瘤质量和体积,降低p-AKT、p-GSK-3β、Snail蛋白表达(P<0.05);SC-79逆转山奈酚对移植瘤的抑制作用,促进AKT/GSK-3β/Snail通路蛋白表达(P<0.05)。结论:山奈酚能抑制鼻咽癌细胞增殖和EMT,促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制AKT/GSK-3β/Snail信号通路有关。

下调Ppp1r17对小鼠饮酒相关行为及AKT/GSK-3β/CREB信号通路磷酸化的影响

目的:观察下调蛋白磷酸酶1调节因子亚基17(Ppp1r17)对小鼠饮酒相关行为的作用,并分析其对蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)/cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)通路磷酸化的影响。方法:取40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组(n=10):control组;shPpp1r17①组;shPpp1r17②组和shPpp1r17③组。给予AAV-shPpp1r173周后检测其在海马组织中的mRNA和蛋白表达水平。取20只雄性C57BL/6J小鼠随机分为control组和shPpp1r17组(n=10)。注射AAV-shPpp1r173周后进行旷场实验、条件性位置偏好实验和翻正反射实验,并检测AAV-shPpp1r17定位及蛋白表达情况。取20只雄性C57BL/6J小鼠分为4组(n=5):shNC+Water组、shNC+EtOH组、shPpp1r17+Water组和shPpp1r17+EtOH组,其中EtOH组小鼠稳定自主饮用9%酒精30 d。Western blot检测Ppp1r17、p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β、p-CREB和CREB蛋白表达情况。结果:(1)实时荧光定量PCR结果显示下调序列shPpp1r17①为最佳Ppp1r17下调序列。(2)行为学结果显示,shPpp1r17组小鼠以增强运动能力和减少焦虑样情绪为特征,Ppp1r17下调可以增加饮酒CPP分数,并降低小鼠对酒精的敏感性。(3)免疫荧光结果显示,shPpp1r17可以在海马脑区特异性表达。(4)Western blot结果显示,在慢性酒精暴露后,Ppp1r17蛋白表达、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β和p-CREB/CREB的比值均显著增加。而在海马敲减Ppp1r17后,Ppp1r17蛋白表达显著降低,并且增强AKT/GSK-3β/CREB通路的活性。结论:Ppp1r17下调后可以增强酒精对小鼠的奖赏效应、增强小鼠的运动能力并降低小鼠对酒精的敏感性,其机制可能与激活AKT/GSK-3β/CREB信号通路有关。

萸蓉壮骨膏调控EZH2/Wnt3a/β-catenin通路促进绝经后骨质疏松大鼠成骨分化

目的基于EZH2/Wnt3a/β-catenin通路调控成骨分化探讨萸蓉壮骨膏对绝经后骨质疏松大鼠的治疗作用及机制。方法取SD大鼠复制绝经后骨质疏松模型,模型构建成功后随机分为模型组、阿仑膦酸钠片组[6.3 mg/(kg·周)]及萸蓉壮骨膏高[10.8 g/(kg·d)]、中[5.4 g/(kg·d)]、低剂量[2.7 g/(kg·d)]组,另选同龄大鼠作为假手术组。Micro CT检测骨微结构,HE染色观察股骨组织病理形态;IF法检测大鼠股骨组织中成骨相关蛋白(Runx2、OSX、OPG)表达水平。RT-qPCR及Western blot法检测大鼠胫骨组织中EZH2、Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠骨微结构(BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp)显著破坏(P<0.05),骨小梁排列稀疏松散,结构出现不连续间断,脂滴累积较多,骨组织中成骨蛋白表达显著降低(P<0.05),EZH2 mRNA和蛋白表达水平显著升高,Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠骨微结构显著改善(P<0.05),各给药组不同程度改善模型大鼠骨组织病理结构,各给药组大鼠骨组织中成骨蛋白表达不同程度增加(P<0.05),各给药组大鼠骨组织中EZH2 mRNA和蛋白表达水平显著降低,Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。结论萸蓉壮骨膏能够显著改善绝经后骨质疏松大鼠骨流失,其作用机制与萸蓉壮骨膏调控EZH2/Wnt3a/β-catenin通路促进成骨分化有关。