GSK-J4通过抑制STAT3磷酸化对HepG2肝癌细胞凋亡和侵袭的影响

目的探讨GSK-J4通过抑制组蛋白去甲基化酶含Jumonji结构域蛋白3(Jumonji domain-containing protein 3,Jmjd3)并上调H3K27me3的表达影响HepG2肝癌细胞凋亡和侵袭的分子机制。方法体外培养人正常肝细胞L02及人肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞株HepG2、SMMC7721,RT-PCR检测Jmjd3 m RNA表达,Western blot检测Jmjd3、H3K27me3蛋白表达;CCK-8法检测不同浓度GSK-J4(0、10、30、50μmol/mL)处理HepG2后增殖能力;流式细胞仪检测凋亡率;Transwell检测细胞侵袭力;Western blot检测Jmjd3、H3K27me3和凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Caspase3、上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标记物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)以及p-STAT3、STAT3蛋白表达。结果与L02比,Jmjd3高表达,H3K27me3低表达于HepG2、SMMC7721肝癌细胞株(P<0.05);GSK-J4抑制HepG2增殖(P<0.05);GSK-J4处理组细胞凋亡率明显提高,细胞侵袭能力减弱(P<0.05);GSK-J4处理HepG2后Jmjd3水平降低,H3K27me3水平增高,Bcl2水平降低,Bax、Caspase3水平增高,E-cadherin表达增高,Vimentin水平降低(P<0.05);p-STAT3表达下调(P<0.01)。结论 GSK-J4通过抑制Jmjd3并上调H3K27me3表达而诱导HepG2发生凋亡并减弱侵袭,其可能与抑制EMT形成和STAT3的磷酸化有关。

GSK-J4对人结肠癌细胞的增殖抑制作用

目的:评价JMJD3抑制剂GSK-J4对人结肠癌细胞的抑制能力,并探讨其作用机制。方法:噻唑蓝比色(MTT)法测定癌细胞抑制率,克隆形成方法评价癌细胞的增殖能力,Transwell实验评价癌细胞的侵袭能力,流式细胞术分析癌细胞的凋亡和细胞周期状态,蛋白免疫印迹实验评价癌细胞内相关蛋白的表达水平。结果:GSK-J4对多种人结肠癌细胞的半抑制浓度IC_(50)为(0.71~4.57)μmol/L,能抑制癌细胞的增殖和侵袭,诱导细胞凋亡及S期细胞阻滞,上调癌细胞内H3K27位三甲基化水平,并且上调凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-7、Cleaved PARP和细胞周期相关蛋白p27 Kip1的表达。结论:GSK-J4可以上调凋亡和细胞周期相关蛋白,促进癌细胞的内源性凋亡和S期阻滞,抑制多种人结肠癌细胞如HCT116、DLD-1的生长增殖和侵袭。

组蛋白去甲基化酶JMJD3抑制剂GSK-J4对神经胶质瘤细胞迁移的影响

【目的】明确组蛋白去甲基化酶(jumonji-domain containing protein 3,JMJD3)抑制剂GSK-J4对神经胶质瘤细胞迁移能力的影响。【方法】用含有不同终浓度GSK-J4的培养基对U87和U251细胞进行培养,然后采用Real-time PCR、Western blotting、划痕和迁移小室等检测手段从mRNA、蛋白表达和细胞功能三个层面明确GSK-J4对神经胶质瘤细胞迁移能力的影响。【结果】在U87和U251细胞中,GSK-J4能够显著升高细胞中H3K27的甲基化水平,在一定程度上降低细胞增殖能力,有效降低细胞的迁移能力;同时GSK-J4能够促进上皮标志分子(E-cadherin/Zo1),抑制间质标志分子(N-cadherin/Fibronectin/Vimentin)、上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关信号通路中的关键调控基因(TGF-β1/β-catenin/Snail/Slug/Twist/Zeb1)和维持细胞干性的关键基因(Sox2/Oct4/Nanog)的mRNA的表达。【结论】GSK-J4能够抑制神经胶质瘤细胞EMT过程和细胞干性调控关键基因的表达从而降低细胞迁移能力。

组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK⁃J4减轻高脂诱导的肥胖小鼠体质量

目的研究组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK-J4如何降低高脂诱导的肥胖小鼠体质量。方法使用高脂饲料(HFD)喂养C57/BL6小鼠16周后,连续腹腔注射GSK-J416 d,在此期间监测小鼠体质量和体温。ELISA试剂盒检测血清瘦素的表达。流式细胞测量术检测附睾和皮下脂肪组织中巨噬细胞的极化方向。HE染色和免疫组化的评价附睾脂肪组织和皮下脂肪组织中白色脂肪棕色化程度。RT-qPCR分析巨噬细胞中相关细胞因子和氧化磷酸化相关基因的表达水平。结果与溶剂对照组相比,GSK-J4时间依赖性降低小鼠体质量;显著降低血清中瘦素表达水平(P<0.01);减少附睾和皮下脂肪组织巨噬细胞的表面标志物CD11c+减少;增加皮下白色脂肪棕色化程度;刺激棕色脂肪组织中氧化磷酸化相关基因mRNA水平表达,降低IL-1β表达水平。结论组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK-J4可以减少巨噬细胞的M1极化。GSK-J4处理小鼠后可显著降低HFD所致肥胖小鼠的体质量,增加能量消耗。

组蛋白H3K27甲基化对人高分化鼻咽癌细胞系CNE-1增殖的抑制效应

目的分析特异性阻断组蛋白H3K27me3/2去甲基化反应对人高分化鼻咽癌CNE-1细胞增殖能力的调控作用及其分子机制。方法体外培养人鼻咽癌细胞系CNE-1,运用组蛋白H3K27me3/2去甲基化酶抑制剂GSK-J4特异性阻断组蛋白H3K27me3/2去甲基化反应。用含0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L的GSK-J4培养基(10%FBS的RPMI-1640培养液)作用于CNE-1细胞作为实验组,同时设溶剂对照(DMSO,二甲基亚砜)。激光共聚焦技术和流式细胞计量术分析细胞内组蛋白H3K27me3的表达水平;实时荧光定量PCR技术检测细胞内cyclinD1和Ki-67 mRNA的表达水平;用CCK-8法检测细胞的增殖活性;平板集落实验检测细胞集落形成能力;流式细胞计量术检测细胞周期的分布。结果实验组细胞内组蛋白H3K27me3表达水平较对照组明显增高(P<0.05);实验组细胞内cyclinD1和Ki-67 mRNA表达水平较对照组明显下调(P<0.05);CNE-1细胞活力随GSK-J4作用浓度的增加逐渐降低,呈浓度依赖性;实验组细胞增殖活力和集落形成能力较对照组明显下降(P<0.05);实验组G0/G1期细胞百分数较对照组增多,S期减少(P<0.05)。结论上调CNE-1细胞内组蛋白H3K27的甲基化修饰水平可以诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,作用机制可能与下调cyclinD1和Ki-67 mRNA水平相关。

组蛋白H_(3)K_(27)me_(3)对糖尿病肾病小鼠足细胞损伤的作用

目的:选用自发性2型糖尿病db/db小鼠,探讨组蛋白H_(3)K_(27)me_(3)异常修饰对糖尿病肾病小鼠足细胞损伤的机制。方法:选择db/m小鼠作为对照组(N组,n=20),选用db/db小鼠分别予PBS溶液、GSK-J_(4)尾静脉注射处理作为糖尿病肾病组(D组,n=20)、GSK-J_(4)干预组(G组,n=20)。观察:(1)一般指标:血糖、24h尿蛋白、尿素氮、血肌酐水平。(2)应用免疫组织化学染色法测定小鼠肾组织H_(3)K_(27)me_(3)表达。(3)应用双重免疫荧光染色及激光共聚焦观察肾组织足细胞裂孔膜蛋白Nephrin、Podocin表达。(4)肾脏病理学改变:应用HE染色观察肾脏组织病理变化。(5)应用TUNEL法检测足细胞凋亡程度。结果:(1)与N组相比,D组血糖、24h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐水平增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与D组相比,G组血糖、24h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐水平减低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)肾组织H_(3)K_(27)me_(3)表达:与N组相比,D组肾组织组蛋白H_(3)K_(27)me_(3)表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。G组可恢复肾组织足细胞H_(3)K_(27)me_(3)表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)裂孔膜蛋白Nephrin、Podocin表达:与N组相比,D组肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达减少。G组可恢复肾组织足细胞Nephrin和Podocin表达。(4)肾组织病理学:N组无明显异常,D组肾小球体积增大,肾小球系膜细胞增生,部分基底膜增厚,肾间质可见炎性细胞浸润,肾小管上皮细胞肥大、空泡变性,管腔变窄。与D组相比,G组上述肾脏病理改变减轻。(5)足细胞凋亡程度:与N组相比,D组足细胞凋亡程度升高。G组可减轻足细胞凋亡程度。结论:糖尿病肾病发病过程中,肾组织组蛋白H_(3)K_(27)me_(3)表达减少;给予GSK-J_(4),增加肾组织组蛋白H_(3)K_(27)me_(3)表达,可恢复肾组织Nephrin和Podocin表达,有助于保护足细胞功能和结构完整,发挥减少尿蛋白、延缓糖尿病肾病进展的作用。

组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响研究

目的研究组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成牙本质向分化的影响。方法原代分离培养DPSCs,用流式细胞术和茜素红染色鉴定DPSCs。体外诱导DPSCs成牙本质向分化不同时间(0、3、5、7、14 d),qRT-PCR检测Jmjd3及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)的表达情况。用不同浓度(0、1、10μmol/L)的Jmjd3抑制剂GSK-J4处理DPSCs 14 d,q RT-PCR检测DSPP、DMP1的表达情况。结果原代培养的DPSCs表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD29、CD146,体外诱导培养具有成骨分化潜能。DPSCs成牙本质向分化过程中,Jmjd3、DSPP、DMP1表达水平均上调(P<0.05),且可能具有时间依赖性。10μmol/L GSK-J4处理DPSCs可明显抑制DSPP、DMP1的表达(P<0.05)。结论Jmjd3在DPSCs成牙本质向分化过程中发挥正调节作用,且与其去甲基化酶活性相关。