槲皮素通过调控p38/GSK3β途径调节上皮-间质转化抑制乳腺癌侵袭和转移

目的:探讨黄酮类化合物槲皮素对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞MCF-7侵袭和转移的抑制作用及其具体作用机制。方法:采用0、25、50、100μM槲皮素处理乳腺癌细胞株MCF-7,命名为对照组、25μM组、50μM组和100μM组。分别通过Transwell检测细胞的侵袭和转移,Western Blotting检测上皮间质转化(EMT)相关标记物的表达水平以及p38/GSK3β途径分子的蛋白磷酸化水平。应用小分子抑制剂干扰相关通路后检测细胞侵袭和转移的变化。结果:槲皮素可以浓度依赖的方式抑制MCF-7的迁移、侵袭,E-cadherin的表达上升,N-cadherin和Vimentin表达下降。槲皮素能够以浓度依赖的方式降低p38和GSK3β途径分子的蛋白磷酸化水平。采用p38和GSK3β的抑制剂使E-cadherin的表达上升,N-cadherin和Vimentin表达下降,并抑制MCF-7的迁移和侵袭。结论:槲皮素可抑制TNBC侵袭和转移,其机制主要是通过抑制p38/GSK3β途径实现从EMT向MET的转变。

滋水清肝饮对慢性束缚应激抑郁小鼠海马ERK、GSK3β、CREB、BDNF蛋白表达的影响

目的基于ERK/GSK-3β/CREB/BDNF信号通路探究滋水清肝饮对慢性束缚应激(CRS)抑郁小鼠的作用。方法除空白组外,其余小鼠建立CRS抑郁模型,造模成功后分为模型组、盐酸氟西汀组(10 mg/kg)和滋水清肝饮低、中、高剂量组(8.835、17.670、35.340 g/kg),给予相应剂量药物干预,同时继续进行CRS处理。给药7、14 d进行糖水偏好实验及行为学实验。给药14 d后,HE染色观察小鼠海马组织形态学改变,采用试剂盒检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平,ELISA法检测血清5-羟色胺(5-HT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)水平,RT-qPCR法检测海马组织BDNF、TNF-α、IL-1βmRNA表达,Western blot法检测海马组织ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3β、p-GSK3β、CREB、BDNF蛋白表达。结果与模型组比较,给药14 d后,盐酸氟西汀组和滋水清肝饮中剂量组小鼠糖水偏好率升高(P<0.01),悬尾不动时间和强迫游泳不动时间缩短(P<0.01),海马组织神经细胞损伤有所改善,血清MDA、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05,P<0.01),SOD活性和5-HT水平升高(P<0.05,P<0.01),海马组织TNF-α、IL-1βmRNA表达降低(P<0.01),BDNF mRNA和p-ERK1/2、p-GSK3β、CREB、BDNF蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论滋水清肝饮可改善慢性束缚应激小鼠抑郁样行为,其机制可能与调节小鼠海马ERK/GSK3β/CREB/BDNF信号通路有关。

小红参乙酸乙酯提取物调控PI3K/AKT/GSK3-β通路对心肌缺血再灌注损伤大鼠雌激素的影响

目的研究小红参乙酸乙酯提取物通过调控磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-OH kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/糖原合成酶激酶3-β(glycogen synthase kinase 3-β,GSK3-β)通路对心肌缺血再灌注损伤大鼠雌激素的影响。方法选取SPF级SD雌性大鼠50只,空白组10只,建模中死亡10只,随机分为模型组、低剂量组、高剂量组,每组10只。对照组不做任何处理,模型组、低剂量组、高剂量组进行心肌缺血再灌注损伤模型建模,建模成功后模型组不做任何处理,低剂量组、高剂量组分别给予小红参乙酸乙酯提取物灌胃,其剂量分别为56.7 mg/kg、280 mg/kg。观察大鼠心肌损伤[肌钙蛋白I(CTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)]、氧化应激[丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)]、一氧化氮(NO)、内皮-氧化氮合酶(eNOS)含量、性激素、PI3K/AKT/GSK3-β信号通路表达量情况。结果与空白组比较,模型组、低剂量组、高剂量组cTnI、CK-MB、MDA、E2水平均升高(P<0.05),SOD、GSH-Px、NO、eNOS水平、PI3K、AKT、GSK3-β表达均降低(P<0.05);与模型组比较,低剂量组、高剂量组cTnI、CK-MB、MDA、E2水平均降低(P<0.05),SOD、GSH-PxNO、eNOS水平、PI3K、AKT、GSK3-β表达均升高(P<0.05);与低剂量组比较,高剂量组cTnI、CK-MBE2水平均降低(P<0.05),SOD、GSH-PxNO、eNOS水平、PI3K、AKT、GSK3-β表达均升高(P<0.05)。结论小红参乙酸乙酯提取物能对心肌缺血再灌注损伤大鼠能心肌损伤情况进行改善,抑制氧化应激状态,恢复雌激素水平,通过调节PI3K/AKT/GSK3-β通路能够反映出对心肌缺血再灌注损伤的干预效果。

GM1通过PI3K/AKT/GSK3β信号通路减轻脑出血小鼠的神经功能损伤

目的研究单唾液酸四己糖基神经节苷脂(GM1)对急性脑出血小鼠的神经功能保护作用及其机制。方法构建小鼠脑出血神经损伤模型。将小鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、GM1(25 mg/(kg·d))组、GM1+LY294002(6μg/(kg·d))组各10只。于造模结束1 h后腹腔注射GM1或LY294002,连续1 w,Sham组和Model组腹腔注射等量生理盐水。采用神经功能缺损评分、脑含水量等检测各组神经功能损伤;苏木素-伊红(HE)染色试剂盒和尼氏染色试剂盒检测各组脑组织和神经元损伤水平;酶联试验免疫吸附试验(ELISA)法测定血清炎性因子白细胞介素(IL)-6、IL-1β及肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;Western印迹检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解的胱天蛋白酶(cleaved caspase)-3、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶(PI3K/AKT/GSK)3β蛋白表达。结果与Sham组相比,Model组神经功能损伤严重(P<0.05),且神经细胞出现大量凋亡。Western印迹结果显示,Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达明显下调,Bax、cleaved caspase-3、p-GSK3β/GSK3β蛋白表达明显上调(P<0.05);与Model组相比,GM1治疗组神经功能损伤明显减轻,脑组织损伤和炎症明显减轻且神经细胞凋亡明显被抑制(P<0.05),而GM+LY294002使得这一治疗作用明显被弱化(P<0.05)。结论GM1能有效保护急性脑出血小鼠的神经功能,其作用机制可能与PI3K/AKT/GSK3β信号通路有关。

基于ERK1/2-GSK3β-NFκB信号通路探究芪黄苁蓉通便散贴敷对肾衰竭大鼠肠道菌群及肾功能的影响

目的 研究基于细胞外信号调节激酶(ERK)1/2-糖原合成酶激酶(GSK)3β-核因子(NF)κB信号通路探究芪黄苁蓉通便散贴敷对肾衰竭大鼠肠道菌群及肾功能的影响。方法 40只SD大鼠随机抽取10只作为健康组进行对照,剩余建立慢性肾衰竭(CRF)模型,建模成功后分为模型组、治疗组(芪黄苁蓉通便散贴)、药物对照组(复元四红散)各10只。运用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肾功能、氧化应激相关指标水平,苏木素-伊红(HE)、Masson染色观察肾组织病理形态学,采集粪便检测肠道细菌种类及数量,Western印迹检测ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相关蛋白。结果 与健康组相比,模型组尿素氮、血肌酐、尿酸、丙二醛、肠球菌、肠杆菌、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3β、p-GSK3β、NFκBp65、p-NFκBp65、单核细胞趋化蛋白-1、细胞间黏附分子-1升高,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、双歧杆菌、乳酸杆菌水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,治疗组与药物对照组均有所改善,且以治疗组效果显著(P<0.05)。健康组肾组织结构正常;模型组肾小球变形,肾小管扩张,大量炎性细胞浸润;与模型组相比,治疗组与药物对照组均有所改善。Masson染色显示,健康组结构正常;模型组出现肾组织肾小管发生变性、萎缩、破坏及再生等病理改变,间质中单核与淋巴细胞浸润及胶原纤维表达最多;治疗组与药物对照组肾小管、间质的病理改变得到有效改善,蓝色胶原纤维沉积也呈下降趋势。结论 芪黄苁蓉通便散贴可能是通过抑制ERK1-2-GSK3β-NF-κB通路的激活,改善CRF大鼠肠道菌群及肾功能。

6-姜酚通过Akt/GSK3-β信号通路改善心肌缺血再灌注损伤的研究

目的通过Akt/GSK3-β信号通路研究6-姜酚对心肌缺血再灌注损伤(I/R)的影响。方法(1)选取相同月龄的健康雄性Wistar大鼠32只,依据随机数字表法将大鼠分为对照组1、I/R1组、I/R+2 mg/kg组及I/R+4 mg/kg组各8只,对I/R1组、I/R+2 mg/kg组及I/R+4 mg/kg组制备I/R模型,分别给予I/R+2 mg/kg组及I/R+4 mg/kg组2 mg/kg及4 mg/kg的6-姜酚溶液2 mL灌胃,对照组1及I/R1组大鼠灌注等量蒸馏水。比较各组干预后心肌细胞凋亡水平、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、血清乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核因子κB(NF-κB)、Akt、p-Akt、GSK3-β及p-GSK3-β表达水平。(2)H9C2心肌细胞分为对照组2、I/R2组、I/R2+50 mmol/L组、I/R2+100 mmol/L组,每组3份。对I/R2组、I/R2+50 mmol/L组、I/R2+100 mmol/L组H9C2心肌细胞建立I/R模型,分别将对照组2、I/R2组、I/R2+50 mmol/L组及I/R2+100 mmol/L组H9C2心肌细胞置于含有0 mmol/L、0 mmol/L、50 mmol/L和100 mmol/L的6-姜酚DMEM培养基中,比较H9C2心肌细胞干预后的凋亡水平、Caspase-3、LDH、Akt、p-Akt、GSK3-β、p-GSK3-β的表达水平。结果(1)I/R+4 mg/kg组的细胞凋亡面积及Caspase-3、LDH、IL-6、TNF-α及NF-κB水平均低于I/R1组(P<0.05),且I/R+4 mg/kg组的细胞凋亡面积及Caspase-3及IL-6水平低于I/R+2 mg/kg组(P<0.05);I/R+4 mg/kg组的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均高于I/R1组及I/R+2 mg/kg组(P<0.05)。(2)I/R2+100 mmol/L组的细胞凋亡率、Caspase-3及LDH均低于I/R2组及I/R2+50 mmol/L组(P<0.05),I/R2+100 mmol/L组的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均高于I/R2组及I/R2+50 mmol/L组(P<0.05)。结论6-姜酚处理后的大鼠心肌细胞I/R程度显著减轻,炎症因子降低,心肌细胞的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β信号通路相关蛋白比值升高,考虑6-姜酚通过激活Akt/GSK3-β信号通路达到改善心肌I/R的效果。

基于PI3K/AKT/GSK3β信号通路探讨“还神至圣汤”对AD大鼠学习记忆的影响

目的:Aβ25-35淀粉酶注射SD大鼠建立老年痴呆大鼠(AD)模型,评价还神至圣汤对AD大鼠学习记忆能力的影响。方法:50只SD大鼠随机分为正常对照组,模型组、实验药物10.2、20.4、40.8 g.kg^(-1)剂量组,10只/组。除正常对照组外,其余各组大鼠海马区注射Aβ25-35淀粉酶建立AD模型。建模后第2天各组动物每日给药,连续30天,正常对照组、模型组给予等体积生理盐水,末次给药后24 h,剖取大鼠右侧海马组织,采用WB法测定海马区PI3K、AKT、P-AKT、GSK3β、P-GSK3β蛋白水平。模型建立后14天,开展Morris水迷宫实验测定AD大鼠学习记忆能力。结果:还神至圣汤各剂量组明显减少平台逃避潜伏期,提高穿越平台次数和目标象限停留时间百分比(P<0.05)。还神至圣汤20.4、40.8 g.kg^(-1)剂量组PI3K、p-Akt、p-GSK3β蛋白含量有明显增加(P<0.05,40.8 g.kg^(-1)剂量组p-GSK3β除外)。P-Akt/Akt、P-GSK3β/GSK3β比值也明显增加(P<0.05)。结论:还神至圣汤可改善由Aβ25-35淀粉样蛋白诱导的AD模型大鼠的学习记忆能力,其作用可能通过调控PI3K/AKT/GSK3β通过信号通路实现的。

METTL14通过PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路调控巨噬细胞分化对宫颈癌细胞凋亡和增殖的影响

目的探讨METTL14通过调控巨噬细胞分化抑制宫颈癌病理性发展及相关机制。方法检测宫颈癌病变样本METTL14 m RNA和蛋白,以及IL-6、iNOS、Arg-1和CD206表达变化。PMA诱导THP-1细胞转化为巨噬细胞,慢病毒过表达或抑制METTL14表达,检测IL-6、iNO、Arg-1和CD206表达变化以及PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路相关蛋白表达情况。随后加入PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路激动剂和抑制剂,检测过表达或抑制METTL14后,巨噬细胞IL-6、iNO、Arg-1和CD206表达变化,并取其上清制成条件培养基,孵育Hela细胞,检测细胞凋亡和增殖情况。结果1)宫颈癌病变组织中METTL14 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),巨噬细胞M1型标志物IL-6和iNOS表达明显降低(P<0.05),而M2型标志物Arg-1和CD206表达明显升高(P<0.05)。2)巨噬细胞过表达METTL14后,IL-6和iNOS表达明显升高(P<0.05),而Arg-1和CD206表达明显降低(P<0.05),M1/M2比例升高;抑制METTL14表达后,M1型标志物降低(P<0.05),M2型标志物升高(P<0.05),M1/M2比例降低。3)巨噬细胞中转染OE-METTL14慢病毒组PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路被抑制(P<0.05);加入PI3K/AKT激动剂后,M1型标志物降低而M2型标记物升高(P<0.05),M1/M2比例降低;OE-METTL14可逆转此趋势。Sh-METTL14慢病毒组PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路被激活(P<0.05),加入PI3K/AKT抑制剂后,M1型标志物升高而M2型标记物降低(P<0.05),M1/M2比例升高;Sh-METTL14可逆转此趋势。4)取转染OE-METTL14慢病毒后的巨噬细胞上清培养Hela细胞,可见细胞凋亡明显增多(P<0.05),增殖明显减少(P<0.05)。Sh-METTL14组的Hela细胞则表现出细胞凋亡减少(P<0.05),增殖增多(P<0.05)。结论METTL14通过PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路调控巨噬细胞分化可能有促进宫颈癌细胞凋亡,抑制增殖的作用。

骨髓间充质干细胞外泌体源性miR-128调控GSK3B参与脑梗死进展

目的探索骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCS)外泌体源性miR-128调控GSK3B对脑梗死大鼠自噬与炎性反应的影响。方法分离BM-MSCS及外泌体,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)对miR-128与GSK3B的表达量进行检测,双荧光素酶报告实验验证miR-128和GSK3B的靶向关系,Western blot法检测自噬相关蛋白(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)的表达,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测组织中炎性细胞因子(TNF-α、IL-6)分泌水平。结果与sham组大鼠比较,大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠脑组织中miR-128表达下调,但miR-128在BM-MSCS外泌体中表达上调(P<0.05)。外泌体处理或上调外泌体中miR-128表达能降低MCAO大鼠脑组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达,抑制TNF-α、IL-6浓度(P<0.05)。但下调外泌体中miR-128表达则相反。miR-128与GSK3B的靶向关系被验证,下调miR-128的作用被si-GSK3B部分抵消。结论BM-MSCS外泌体源性miR-128通过靶向GSK3B抑制脑梗死大鼠自噬与炎性反应。

基于ALKBH5调控GSK3β/mTOR通路抑制过度自噬探讨速效救心丸减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用机制

目的:基于HL-1细胞自噬水平及相关通路关键蛋白表达探讨速效救心丸经Alk B同源蛋白5(ALKBH5)信号转导调控糖原合成酶激酶3β(GSK3β)/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)通路抑制过度自噬而发挥对心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤保护作用的机制。方法:构建慢病毒干扰载体,筛选最佳干扰慢病毒。将HL-1细胞随机分为3组,并进行空白转染、ALKBH5转染、GSK3转染,各组再随机分为4组分别进行缺氧/复氧(模型组)、缺氧/复氧+速效(速效组)、缺氧/复氧+川芎嗪(川芎嗪组)、缺氧/复氧+冰片(冰片组)处理。通过自噬双标腺病毒(m RFP-e GFP-LC3)双荧光染色检测自噬流,细胞计数法(CCK8)检测细胞增殖,双染色双变量流式细胞分析法(Annexin V/PI)检测细胞凋亡,透射电镜观察自噬小体的数量和形态,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测GSK3β、m TOR含量及自噬相关基因(Atg)5、苄氯素1(Beclin1)、自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)、自噬标志物p62蛋白表达。结果:ALKBH5过表达可抑制GSK3β表达,增强m TOR表达(P<0.05)。CCK8法检测m RFP-e GFP-LC3的双荧光染色检测自噬流结果显示,与空白转染比较,ALKBH5转染可促进自噬,GSK3β转染可抑制自噬(P<0.05)。CCK8法检测细胞增殖结果显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组均可促进细胞增殖;与空白转染比较,ALKBH5组可抑制细胞增殖,GSK3β可促进细胞增殖(P<0.05)。Annexin V/PI双染色法检测心肌细胞凋亡显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组均可抑制细胞凋亡;与空白组比较,ALKBH5转染及GSK3β转染均可增加细胞凋亡(P<0.05)。Western Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达,增强m TOR表达(P<0.05)。与空白转染比较,ALKBH5转染可增强LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达,抑制m TOR表达;GSK3β转染可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达,增强m TOR表达(P<0.05)。结论:速效救心丸及其有效成分冰片、川芎嗪经ALKBH5/GSK3β/m TOR信号通路抑制过度自噬,减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤。

三角帆蚌Hc-GSK3β基因鉴定及内壳色性状相关SNP筛选

为了探究三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)糖原合成激酶-3β(GSK3β)基因对壳色的影响,研究采用RACE技术获得Hc-GSK3β基因cDNA全长1867 bp,其中包含1261 bp的ORF区编码420个氨基酸,ORF中含有一个S_TKc结构域,该结构域序列高度保守。组织差异表达分析发现Hc-GSK3β基因在紫色蚌鳃、斧足、内脏团和边缘膜组织中表达量高于白色蚌的表达量(P<0.05),且在斧足和边缘膜表达差异水平达到极显著(P<0.01),而在紫色蚌闭壳肌组织中表达量显著低于白色蚌(P<0.05)。原位杂交(ISH)实验结果显示在三角帆蚌外套膜的外褶、中褶、内褶、背膜区和腹膜区均有阳性信号产生,且在外褶的信号表达较强烈。该基因经重测序比较,共鉴定出6个SNP位点,其中在C+185A位点的CA基因型在紫色蚌的分布频率显著高于白色三角帆蚌(P<0.05);在紫色蚌中,T+341G位点TT基因型三角帆蚌内壳颜色参数b值显著低于TG基因型(P<0.05)。研究表明,Hc-GSK3β基因参与了三角帆蚌壳色形成,筛选的SNP标记可用于三角帆蚌壳色育种。

槐耳多糖通过抑制AKT/GSK3β/Snail信号通路抑制胰腺癌细胞增殖和上皮间质转化

目的:探讨槐耳多糖(HP)调节丝苏氨酸蛋白激酶B(AKT)/糖原合酶激酶-3β(GSK3β)/锌指转录因子(Snail)信号通路对胰腺癌(PC)细胞增殖、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响。方法:将人胰腺癌SW1990细胞分为:Control组(正常培养)、HP低浓度组(1μg/mL)、HP中浓度组(5μg/mL)、HP高浓度组(10μg/mL)、激活剂组(10μg/mL HP+10μmol/L AKT/GSK3β/Snail通路激活剂SC79);四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;黏附实验检测细胞黏附能力;划痕实验检测细胞迁移;Transwell小室检测细胞侵袭;蛋白免疫印迹法(Western blot)方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞抗凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)及AKT/GSK3β/Snail通路蛋白的表达。结果:与control组比较,HP低、中、高浓度组SW1990细胞OD490值、黏附细胞数、划痕愈合率、侵袭数、PCNA、Bcl-2、MMP-2、Vimentin、N-cadherin、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β、Snail蛋白表达水平降低,细胞凋亡率及Bax、E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05);与HP高浓度组比较,激活剂组SW1990细胞OD490值、黏附细胞数、划痕愈合率、侵袭数、PCNA、Bcl-2、MMP-2、Vimentin、N-cadherin、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β、Snail蛋白表达水平升高,细胞凋亡率及Bax、E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:HP可能通过抑制AKT/GSK3β/Snail信号通路,抑制SW1990细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,促进凋亡。

LIMP-2 enhances cancer stem-like cell properties by promoting autophagy-induced GSK3β degradation in head and neck squamous cell carcinoma

Cancer stem cell-like cells(CSCs)play an integral role in the heterogeneity,metastasis,and treatment resistance of head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC)due to their high tumor initiation capacity and plasticity.Here,we identified a candidate gene named LIMP-2 as a novel therapeutic target regulating HNSCC progression and CSC properties.The high expression of LIMP-2 in HNSCC patients suggested a poor prognosis and potential immunotherapy resistance.

基于TRPM2/Akt/GSK3β通路探讨24-乙酰泽泻醇A保护脑缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞的机制

目的:探讨24-乙酰泽泻醇A(24A)改善小鼠脑缺血再灌注后脑微血管内皮细胞(BMECs)损伤的作用机制。方法:将45只雄性10周龄C57BL/6小鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、24A组,每组15只。模型组、24A组采用20 min双侧颈总动脉结扎后再灌注的方法构建小鼠脑缺血再灌注损伤(CI/RI)模型,假手术组小鼠只分离颈总动脉和迷走神经,不结扎。24 A组采用24 A灌胃,剂量为30 mg/(kg·d);假手术组和模型组则给予等体积的生理盐水进行灌胃,3组均灌胃1次/d,连续干预7 d。分别采用神经功能缺损评分(mNSS)评估小鼠神经功能受损程度;采用新物体识别测试(NORT)和水迷宫(MWM)评价小鼠认知功能;采用免疫荧光法检测内皮细胞CD31表达;采用Western blot法检测脑组织闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)、紧密连接蛋白-5(Claudin-5)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、瞬时受体电位离子通道-2(TRPM2)、磷酸化苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)、磷酸化糖原合成酶激酶-3(p-GSK3β)蛋白表达水平。结果:①神经功能:与假手术组比较,模型组mNSS在第1、3、5、7天均明显升高(P<0.05);与模型组比较,24A组第3、7天mNSS明显降低(P<0.05)。②认知功能:与假手术组比较,模型组NORT 1、24 h识别指数明显降低(P<0.05);与模型组比较,24A组NORT 1、24 h识别指数明显升高(P<0.05)。与假手术组比较,模型组干预后第2~4天逃避潜伏期明显延长,穿越目标平台次数明显减少(P<0.05);与模型组比较,24A组干预后第3、4天逃避潜伏期明显缩短,穿越目标平台次数明显增加(P<0.05)。③内皮细胞CD31、ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达:假手术组CD31荧光表达较为密集,呈现红色荧光;与假手术组比较,模型组CD31荧光表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,24A组CD31荧光表达明显升高(P<0.05)。与假手术组比较,模型组ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达量明显下降(P<0.05);与模型组比较,24A组ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达量明显升高(P<0.05)。④p-NF-κB、IL-1β、TNF-α、TRPM2、p-Akt、p-GSK3β蛋白表达:与假手术组比较,模型组p-NF-κB、IL-1β、TNF-α、TRPM2表达明显增加,p-Akt、p-GSK3β表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,24A组p-NF-κB、IL-1β、TNF-α、TRPM2蛋白表达水平明显下降,p-Akt、p-GSK3β表达明显增加(P<0.05)。结论:24A可有效改善CI/RI小鼠的神经功能、认知功能,降低炎症反应,改善BMECs损伤,其机制可能与TRPM2/Akt/GSK3β通路的调控有关。

心衰与PI3K-Akt-GSK3β通路的关系及中医药的研究进展

近年来,慢性心衰的心肌重构受到了医学工作者的广泛认识。而心室重构发生的分子生物学机制尤其是信号转导途径中的磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸苏氨酸蛋白激酶-糖原合成激酶3β(PI3K-Akt-GSK3β)通路一直是临床及科研的热点。并且成为近年来对在心力衰竭发病机制及治疗作用靶点的研究重点。随着中医药的现代化研究发展,中药干预心衰大鼠信号转导途径的研究也取得了一定的研究成果。

GSK3抑制剂氯化锂对脆性X综合征模型小鼠避暗行为的干预作用

目的探讨糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase3,GSK3)抑制剂氯化锂对脆性X综合症小鼠模型的避暗行为的干预作用及机制。方法通过对30日龄脆性X综合症小鼠连续腹腔注射不同剂量氯化锂5 d,用药第4天和第5天进行避暗实验;同时用免疫印迹技术检测Fmr1 knockout(KO)及wild type(WT)小鼠的海马和皮层总GSK 3β和磷酸化GSK 3β(P-GSK3β)的变化。结果在避暗实验中,KO鼠与WT鼠,两者潜伏期及错误次数分别为(56±32)s,(83±24)s;(7±3)次,(3±2)次;免疫印迹实验结果:KO鼠皮层及海马P-GSK3β表达平均灰度值分别为69,63;WT鼠皮层和海马均为100。注射氯化锂后,KO鼠和WT鼠总GSK3β无明显改变,而KO鼠60 mg/kg,120 mg/kg,200 mg/kg组皮层P-GSK3β表达平均灰度值分别为:147,151,234;海马P-GSK3β分别为108,111,146,较空白组增多;P<0.05。WT鼠用氯化锂后,潜伏期和错误次数以及P-GSK3β表达变化无统计学意义。结论氯化锂能改善KO鼠的学习记忆能力,可能与氯化锂导致的P-GSK3β的表达增加有关,对脆性X综合征基因敲除小鼠有治疗作用。

辛伐他汀通过Akt/ GSK3β通路抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡

目的观察辛伐他汀对心肌梗死后心肌细胞凋亡的影响并探讨其分子机制。方法结扎大鼠左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型。实验组给予药物处理(辛伐他汀40mg.kg-1),10 d后,超声心动图检测左心室功能参数,生化法检测血脂水平,TUNEL法检测心肌组织中的凋亡心肌细胞,Western blot法检测p-Akt ser473、p-GSK3βser9和β-cate-nin蛋白表达。结果辛伐他汀组TC、LDL-C及TG水平与心肌梗死组比较无差异(P>0.05),辛伐他汀组较心肌梗死组在梗死周边区、远离梗死区心肌细胞凋亡明显减少(P<0.05),左心室功能改善(P<0.05),辛伐他汀上调p-Aktser473、p-GSK3βser9和β-catenin蛋白表达。结论辛伐他汀改善心肌梗死后心功能,可能是通过激活Akt/GSK3β通路,抑制心肌细胞凋亡实现。

复心汤对心力衰竭大鼠PI3K-Akt-GSK3β通路的影响

目的研究复心汤对阿霉素所致心力衰竭大鼠心肌肥厚模型中PI3K-Akt-GSK3β通路在心肌中表达的影响,探讨复心汤对抗心力衰竭的作用机制。方法健康成年的雄性Wistar大鼠75只,随机分为空白组、模型组、卡托普利组、复心汤低剂量组、复心汤高剂量组,除空白组外,其余各组用阿霉素造模后,给予相应干预措施。4周后分别用免疫组化、Western blotting法检测心肌中PI3K、Akt及GSK3β的表达情况,并进行定量分析。结果模型组PI3K、Akt阳性表达面积最高,复心汤低剂量组、卡托普利组、复心汤高剂量组较低,空白组最低;GSK3β蛋白表达情况最高为空白组,卡托普利组、复心汤高剂量组、复心汤低剂量组表达面积较模型组高。结论复心汤治疗心力衰竭与PI3K-Akt-GSK3β通路有关。

基于SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路研究右美托咪定对脓毒症模型大鼠脑损伤的保护机制

目的:通过右美托咪定(Dex)对脓毒症模型大鼠脑损伤中沉默信息调节因子1(SIRT1)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合酶激酶3β(GSK3β)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路的影响,探究其对脑损伤的保护作用机制。方法:选取雄性SD大鼠80只,随机分为假手术组(Sham组)、脓毒症组(CLP组)、CLP+Dex组(10μg/kg Dex)、CLP+Dex+Sirtinol组(10μg/kg Dex+2μL/100 g SIRT1抑制剂Sirtinol),每组20只。造模前2 h,CLP+Dex+Sirtinol组大鼠经侧脑室注射给予Sirtinol;各组大鼠采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症模型(Sham组仅手术但不结扎穿孔)。造模结束后0、3、6 h,CLP+Dex组、CLP+Dex+Sirtinol组大鼠分别腹腔注射Dex(10μg/kg),Sham组和CLP组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。末次给药24 h后,检测大鼠脑组织含水量、伊文思蓝(EB)含量、大脑皮层组织细胞凋亡情况和脑组织中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平,以及海马组织中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表达水平。结果:与Sham组比较,CLP组大鼠脑组织含水量、EB含量、大脑皮层组织凋亡细胞数及脑组织中IL-1β、TNF-α表达水平显著增加或升高(P<0.05);海马组织SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与CLP组比较,CLP+Dex组大鼠脑组织含水量、EB含量、大脑皮层组织凋亡细胞数及脑组织中IL-1β、TNF-α表达水平显著减少或降低(P<0.05);海马组织中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。而Sirtinol可显著逆转Dex的上述脑保护和因子调节作用(P<0.05)。结论:Dex对脓毒症模型大鼠具有脑保护作用,该作用可能是通过激活SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路而发挥抗炎、抗凋亡等作用,从而减轻脑水肿、保护血脑屏障并减轻脑损伤。

GSK3β激活参与缺氧诱导心肌细胞凋亡

目的研究缺氧对心肌细胞糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）及其偶联的信号转导分子激活的影响。方法将培养的心肌细胞暴露于含1％氧的混合气体中，造成缺氧0、3、6、12、24h后，用Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡；MTT法检测细胞存活率；RT—PCR、Western blot方法分别检测心肌细胞GSK-3βmRNA及蛋白磷酸化的变化；RT—PCR法检测caspase-9、-3mRNA表达的改变，分光法检测caspase-9酶活性。结果缺氧24h心肌细胞出现典型的凋亡，细胞存活率显著降低；缺氧3～24h GSK-3β mRNA表达高于对照组，而Ser9位点磷酸化水平在缺氧6～24h明显低于对照组；caspase-9mRNA表达在缺氧3h即开始增高，在随后观察的时相点内持续处于高表达状态，caspase-9酶活性变化趋势与其mRNA表达一致，在缺氧3h开始增高，并在缺氧6～24h逐渐升高；caspase-3mRNA表达在缺氧12h、24h明显高于对照组。结论缺氧可以激活GSK3β，并进一步激活GSK3β下游介导的与细胞凋亡相关的蛋白激酶家族成员caspase-9、-3，从而导致心肌细胞凋亡。