基于SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路研究右美托咪定对脓毒症模型大鼠脑损伤的保护机制

目的:通过右美托咪定(Dex)对脓毒症模型大鼠脑损伤中沉默信息调节因子1(SIRT1)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合酶激酶3β(GSK3β)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路的影响,探究其对脑损伤的保护作用机制。方法:选取雄性SD大鼠80只,随机分为假手术组(Sham组)、脓毒症组(CLP组)、CLP+Dex组(10μg/kg Dex)、CLP+Dex+Sirtinol组(10μg/kg Dex+2μL/100 g SIRT1抑制剂Sirtinol),每组20只。造模前2 h,CLP+Dex+Sirtinol组大鼠经侧脑室注射给予Sirtinol;各组大鼠采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症模型(Sham组仅手术但不结扎穿孔)。造模结束后0、3、6 h,CLP+Dex组、CLP+Dex+Sirtinol组大鼠分别腹腔注射Dex(10μg/kg),Sham组和CLP组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。末次给药24 h后,检测大鼠脑组织含水量、伊文思蓝(EB)含量、大脑皮层组织细胞凋亡情况和脑组织中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平,以及海马组织中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表达水平。结果:与Sham组比较,CLP组大鼠脑组织含水量、EB含量、大脑皮层组织凋亡细胞数及脑组织中IL-1β、TNF-α表达水平显著增加或升高(P<0.05);海马组织SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与CLP组比较,CLP+Dex组大鼠脑组织含水量、EB含量、大脑皮层组织凋亡细胞数及脑组织中IL-1β、TNF-α表达水平显著减少或降低(P<0.05);海马组织中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。而Sirtinol可显著逆转Dex的上述脑保护和因子调节作用(P<0.05)。结论:Dex对脓毒症模型大鼠具有脑保护作用,该作用可能是通过激活SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路而发挥抗炎、抗凋亡等作用,从而减轻脑水肿、保护血脑屏障并减轻脑损伤。

GSK3β/β-catenin信号通路在运动和氟西汀改善CUMS小鼠抑郁行为中的作用机制

目的探究游泳运动和氟西汀对CUMS小鼠抑郁行为及GSK3β/β-catenin信号通路的影响。方法采用雄性C57BL/6小鼠,随机分为5组,每组8只:Con组,即普通控制组;CUMS组,实验小鼠接受7周的慢性不可预见性温和应激;CUMS+Saline组,从应激的第4周开始腹腔注射生理盐水4周;CUMS+Flu组,从应激的第4周开始腹腔注射抗抑郁药物氟西汀(Fluoxetine,Flu)4周;CUMS+Swim组,从应激的第4周开始进行游泳训练4周。实验干预结束后,所有小鼠接受行为学检测。断头处死取海马组织,采用Western blotting技术检测相关基因的蛋白表达水平。结果 (1)行为学实验显示,与Con组相比,CUMS组糖水偏好显著降低(P<0.05),强迫游泳(FST)和悬尾实验(TST)不动时间显著增加(P<0.01),开场实验(OFT)探洞次数显著减少(P<0.05);与CUMS+Saline组相比,CUMS+Flu组糖水偏好显著增加(P<0.05),FST和TST不动时间显著减少(P<0.05),OFT探洞次数显著增加(P<0.01);与CUMS组相比,CUMS+Swim组糖水偏好无显著变化,FST(P<0.05)和TST(P<0.01)不动时间显著减少,OFT探洞次数显著增加(P<0.01)。(2)Western blotting实验显示,与Con相比,CUMS组海马组织中pGSK3β(Ser9)、β-catenin的蛋白水平显著降低(P<0.05);与CUMS+Saline相比,CUMS+Flu组海马组织中β-catenin的蛋白水平显著升高(P<0.05),GSK3β、pGSK3β(Ser9)、pGSK3β(Tyr216)的蛋白水平无显著变化;与CUMS组相比,CUMS+Swim组海马组织中GSK3β(P<0.01)、pGSK3β(Ser9,P<0.05)、β-catenin(P<0.05)的蛋白水平显著升高。结论运动和氟西汀均可缓解CUMS所致的小鼠抑郁行为;慢性应激诱导抑郁行为可能涉及GSK3β/β-catenin信号通路的功能紊乱;运动和氟西汀均提高小鼠对慢性应激的耐受性从而控制抑郁病理进程,二者发挥作用的分子机制有所不同,运动缓解抑郁行为可能涉及纠正海马组织中GSK3β/β-catenin信号通路紊乱,而氟西汀缓解抑郁行为可能是非GSK3β/β-catenin依赖性的。研究论证了慢性应激期的运动干预效果媲美于抗抑郁药物氟西汀,并提出了相应的分子行为学依据。深入探究不同抑郁病理期的运动干预模式及其潜在的分子机制,将为运动抗抑郁的转化研究提供新靶向。

慢性氧化应激激活GSK3β/β-catenin信号通路增强乳腺癌细胞MCF-7活性的机制研究

目的建立MCF-7乳腺癌细胞慢性氧化应激细胞模型,观测MCF-7乳腺癌细胞在慢性氧化应激下的增殖情况,探讨慢性应激状态对乳腺癌增殖、迁移和侵袭的影响及其可能机制。方法 CCK-8法检测MCF-7分别在急性氧化应激和慢性氧化应激干预的情况下的增殖抑制率,通过划痕实验和transwell实验检测慢性氧化应激条件下MCF-7细胞迁移和侵袭的能力。通过ELISA法测定IL-6水平,检测慢性氧化应激模型条件下MCF-7的超氧化物歧化酶活性(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)。qPCR及Western blot检测GSK3β/β-catenin信号通路相关蛋白及RNA表达水平。结果与急性氧化应激比较,慢性氧化应激条件下,MCF-7的增殖能力增强,其SOD和T-AOC的能力也进一步增强。其迁移和侵袭的能力均强于野生型和急性氧化应激下的MCF-7。该结果和IL-6蛋白表达,GSK3β/β-catenin信号通路相关蛋白和RNA表达相一致。同时发现三黄煎剂能够抑制MCF-7慢性氧化应激细胞的增殖。结论慢性氧化应激状态能够促进MCF-7乳腺癌细胞增殖和转移,其机制可能与GSK3β/β-catenin信号通路激活和IL-6表达增加相关。

METTL14通过PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路调控巨噬细胞分化对宫颈癌细胞凋亡和增殖的影响

目的探讨METTL14通过调控巨噬细胞分化抑制宫颈癌病理性发展及相关机制。方法检测宫颈癌病变样本METTL14 m RNA和蛋白,以及IL-6、iNOS、Arg-1和CD206表达变化。PMA诱导THP-1细胞转化为巨噬细胞,慢病毒过表达或抑制METTL14表达,检测IL-6、iNO、Arg-1和CD206表达变化以及PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路相关蛋白表达情况。随后加入PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路激动剂和抑制剂,检测过表达或抑制METTL14后,巨噬细胞IL-6、iNO、Arg-1和CD206表达变化,并取其上清制成条件培养基,孵育Hela细胞,检测细胞凋亡和增殖情况。结果1)宫颈癌病变组织中METTL14 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),巨噬细胞M1型标志物IL-6和iNOS表达明显降低(P<0.05),而M2型标志物Arg-1和CD206表达明显升高(P<0.05)。2)巨噬细胞过表达METTL14后,IL-6和iNOS表达明显升高(P<0.05),而Arg-1和CD206表达明显降低(P<0.05),M1/M2比例升高;抑制METTL14表达后,M1型标志物降低(P<0.05),M2型标志物升高(P<0.05),M1/M2比例降低。3)巨噬细胞中转染OE-METTL14慢病毒组PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路被抑制(P<0.05);加入PI3K/AKT激动剂后,M1型标志物降低而M2型标记物升高(P<0.05),M1/M2比例降低;OE-METTL14可逆转此趋势。Sh-METTL14慢病毒组PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路被激活(P<0.05),加入PI3K/AKT抑制剂后,M1型标志物升高而M2型标记物降低(P<0.05),M1/M2比例升高;Sh-METTL14可逆转此趋势。4)取转染OE-METTL14慢病毒后的巨噬细胞上清培养Hela细胞,可见细胞凋亡明显增多(P<0.05),增殖明显减少(P<0.05)。Sh-METTL14组的Hela细胞则表现出细胞凋亡减少(P<0.05),增殖增多(P<0.05)。结论METTL14通过PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路调控巨噬细胞分化可能有促进宫颈癌细胞凋亡,抑制增殖的作用。

锁阳多糖通过激活PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化

目的从MC3T3-E1小鼠前成骨细胞中PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信号通路的角度,揭示锁阳多糖(cynomorium songaricum polysaccharide,CSP)的促成骨分化机制。方法使用含有不同浓度CSP的成骨诱导液培养MC3T3-E1细胞,在第1、3、5、7天采用MTT法检测细胞活力。随后分为Con组(0μg/m LCSP)、CSP组(100μg/m L CSP)及CSP+BEZ组(100μg/m L CSP及50μmol/L BEZ(PI3K特异性抑制剂));干预14 d后采用茜素红染色观察比较MC3T3-E1的成骨分化情况、Real-time PCR定量分析相关成骨分化m RNA,如Runt相关转录因子2(Runx2)、β-连环蛋白(β-catenin)、骨钙素(Osteocalcin)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)的表达水平;并使用Western blot法检测Runx2、CollagenⅠ、Osteocalcin成骨相关蛋白;PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路蛋白的表达情况,以及免疫荧光检测β-catenin的核易位情况。结果与Con组(0μg/m L)相比,CSP干预均可有效促进MC3T3-E1增殖,100μg/m L的效果更加明显。与Con组比较,CSP可有效促进MC3T3-E1细胞茜素红染色的阳性率,以及成骨相关的m RNA、蛋白表达水平(P<0.05),以及PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin蛋白表达(P<0.05),同时还可促进β-catenin入核;但是这些促进作用均可被BEZ逆转。结论CSP可能通过激活PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin通路,诱导MC3T3-E1细胞成骨分化。

miR-491-5p靶向FGFR4调节GSK3β/β-catenin信号通路对小儿肝母细胞瘤增殖和迁移的影响

目的探讨miR-491-5p靶向FGFR4调节GSK3β/β-catenin信号通路对小儿肝母细胞瘤增殖和迁移的影响。方法qRT-PCR检测小儿肝母细胞瘤组织、瘤旁正常组织、正常肝细胞LO2和肝母细胞瘤细胞HuH-6中miR-491-5p和FGFR4 mRNA的表达,Western blot检测FGFR4蛋白表达;荧光素酶活性分析实验检测miR-491-5p与FGFR4的靶向关系;mimic NC,miR-491-5p mimic、pcDNA3.1质粒和pcDNA3.1-FGFR4质粒分别转染HuH-6细胞,qRT-PCR与Western blot检测FGFR4的表达;CCK-8实验检测HuH-6细胞增殖能力的变化,细胞迁移实验分析HuH-6细胞迁移能力的变化;Western blot实验检测HuH-6细胞中GSK3β/β-catenin信号通路相关蛋白p-GSK3β、p-β-catenin和p-C-myc蛋白的表达。结果小儿肝母细胞瘤组织和肝母细胞瘤细胞HuH-6中miR-491-5p表达量降低,FGFR4表达量升高;荧光素酶活性分析实验表明miR-491-5p靶向调控FGFR4;qRT-PCR和Western blot实验表明miR-491-5p抑制FGFR4表达;CCK-8和细胞迁移实验表明,miR-491-5p mimic抑制肝母细胞瘤细胞HuH-6的增殖和迁移,而pcDNA3.1-FGFR4可逆转miR-491-5p mimic对HuH-6细胞增殖和迁移的抑制作用;Western blot实验显示,miR-491-5p mimic可抑制p-GSK3β、p-β-catenin和p-C-myc蛋白的表达,pcDNA3.1-FGFR4可逆转miR-491-5p mimic对p-GSK3β、p-β-catenin和p-C-myc蛋白的抑制作用。结论miR-491-5p负向调节FGFR4,抑制肝母细胞瘤细胞的增殖和迁移,可能与GSK3β/β-catenin信号通路失活相关。

大蒜素通过GSK-3β/β-catenin信号通路抑制舌鳞状细胞癌EMT的研究

本研究旨在探讨大蒜素(Allicin)对舌鳞状细胞癌上皮向间充质转化(EMT)的影响,并探究其作用机制。本实验采用CCK-8法检测不同剂量大蒜素对HSC-3和HSC-4细胞的生存作用并计算半数抑制作用(IC_(50));划痕和Transwell小室实验测定大蒜素对细胞的迁移能力和侵袭影响;Western Blot检测蛋白表达。结果显示,大蒜素对HSC-3和HSC-4细胞活性有抑制作用且具有时间和剂量依赖性;不同浓度(20、40、60μmol/L)的大蒜素能够抑制HSC-3和HSC-4细胞迁移和侵袭;Western Blot结果显示大蒜素能够升高EMT标志物E-cadherin表达,降低N-cadherin和Vimentin表达,同时对GSK-3β/β-catenin信号通路中P-GSK-3β和β-catenin蛋白起到抑制作用。结果表明,大蒜素能够抑制舌鳞状细胞癌HSC-3和HSC-4细胞侵袭和迁移,其机制可能是通过抑制GSK-3β/β-catenin信号通路逆转EMT发生实现的。

敲低趋化因子受体3通过减弱Wnt/β-catenin信号通路抑制肝母细胞瘤细胞增殖与迁移

目的 探讨CXC趋化因子受体3 (CXC chemokine receptor 3,CXCR3)在肝母细胞瘤(hepatoblastoma,HB)中的作用及机制。方法 收集16例HB组织及其癌旁组织,用免疫组化与Western blot法检测CXCR3蛋白的表达。HB细胞(Huh-6及HepT1)分别转染Con-shRNA、CXCR3-shRNA1和CXCR3-shRNA2后,将其分为Con-shRNA组、CXCR3-shRNA1组和CXCR3-shRNA2组。CCK-8法和EdU染色法检测细胞增殖,划痕法和Transwell法检测细胞迁移与侵袭,Western blot法检测β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc、细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)、基质金属蛋白酶(metallomatrix proteinase,MMP)7及MMP-9的表达。裸鼠异位移植;肿瘤实验检测各组细胞体内成瘤情况及瘤体体积,并用免疫组化检测瘤体组织中MMP-9和Ki67表达。结果 CXCR3在HB组织中表达上调(P<0.01)。与Con-shRNA比较,CXCR3-shRNA1组和CXCR3-shRNA2组Huh-6及HepT1细胞活力、增殖、迁移及侵袭能力均降低(P<0.01),Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达减弱(P<0.01),细胞移植瘤的瘤体生长缓慢且体积明显缩小(P<0.01),瘤体组织中MMP-9和Ki67表达降低(P<0.01)。结论 下调CXCR3可抑制HB细胞的增殖与迁移,其机制可能与减弱Wnt/β-catenin信号有关。

补中益气汤含药血清调控GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路增强A549细胞对顺铂敏感性的研究

目的:探讨补中益气汤含药血清增强A549细胞对顺铂敏感性的机制是否与GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路有关。方法:制备补中益气汤含药血清作用于A549细胞株,随机分为a组(对照血清组)、b组(顺铂组)、c组(补中益气汤组)、d组(补中益气汤含药血清联合顺铂组)。流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测GSK-3β、p-GSK-3β^(ser9)、p-GSK-3β^(tyr216)、β-catenin、survivin蛋白表达。结果:补中益气汤含药血清联合顺铂可降低p-GSK-3β^(ser9)、β-catenin、survivin蛋白表达,提高晚期细胞凋亡率。结论:抑制GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路激活可能是补中益气汤含药血清增强A549细胞对顺铂敏感性的作用机制之一。

去甲斑蝥素干预Wnt/β-catenin信号通路诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡

目的:讨论去甲斑蝥素对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:体外培养人卵巢癌SKOV3细胞,将浓度为52μmol/L去甲斑蝥素作用于人卵巢癌SKOV3细胞后,将卵巢癌SKOV3细胞分为对照组、去甲斑蝥素组(52μmol/L),等待卵巢癌细胞贴壁药物作用6 h后,在倒置显微镜下观察卵巢癌SKOV3细胞的形态学变化,荧光显微镜观察细胞核的变化;药物作用24 h后,采用流式细胞术检测线粒体膜电位的变化情况,采用Western blot法检测药物作用后对卵巢癌SKOV3细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin表达水平的影响。结果:与对照组比较,去甲斑蝥素抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,降低线粒体膜电位,诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡,升高Bax的表达水平,抑制Bcl-2蛋白表达水平,降低Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin的表达水平。结论:去甲斑蝥素诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路相关。

黄精多糖调控Wnt/β-catenin信号通路对膀胱癌UMUC3细胞转移活性的影响

目的探究黄精多糖调控Wnt/β-catenin信号通路对膀胱癌UMUC3细胞转移能力的影响。方法将膀胱癌UMUC3细胞随机分为对照组、黄精多糖组(10μg/mL)和抑制剂组(KYA1797K,5μmol/L)。通过蛋白免疫印迹实验分析UMUC3细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达;MTT实验和细胞集落形成实验分析UMUC3细胞增殖能力;Transwell实验分析UMUC3细胞侵袭能力;细胞划痕实验分析UMUC3细胞迁移率;流式细胞术检测UMUC3细胞凋亡率。结果黄精多糖或抑制剂均可抑制膀胱癌UMUC3细胞的增殖和侵袭能力(P<0.05),降低细胞迁移率(P<0.05),促进膀胱癌UMUC3细胞凋亡(P<0.05),抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活(P<0.05)。结论黄精多糖能够减弱膀胱癌UMUC3细胞的增殖、迁移以及侵袭能力,并能促进膀胱癌UMUC3细胞凋亡,其作用可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路活化有关。

槲皮素基于PI3K/AKT/GSK-3β/β-Catenin通路改善Dox诱导小鼠心肌损伤的机制

目的:研究槲皮素(Que)改善多柔比星(Dox)所致小鼠心肌损伤作用机制。方法:将50只小鼠随机分为正常组(Control)、模型组(Dox)、槲皮素低、中、高剂量组(Que-L、Que-M、Que-H),除Control外腹腔注射Dox建立心肌损伤模型。心脏超声及血流动力学评价小鼠心脏功能,ELISA法检测小鼠血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)与乳酸脱氢酶(LDH)含量,HE染色、Tunel染色、WGA染色分别观察小鼠心肌组织病理变化、心肌细胞凋亡、心肌细胞横截面积变化;免疫荧光检测心肌组织中p-GSK-3β表达,Western blot法检测小鼠心肌组织PI3K/AKT/GSK-3β通路与凋亡蛋白表达。结果:与Control组比较,Dox组小鼠左室射血分数(LVEF)与左室短轴缩短率(LVFS)极显著下降(P<0.01),左心室舒张末期内径(LVEDd)与左心室收缩末期内径(LVEDs)极显著增加(P<0.01),血清中CK-MB与LDH含量极显著增加(P<0.01),心肌细胞肿胀且排列紊乱;心肌组织中PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin表达极显著降低(P<0.01),Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3表达极显著增加(P<0.01)。与Dox组比较,Que各给药组小鼠心肌损伤均有不同程度改善,LVEF与LVFS极显著升高(P<0.01),(LVEDd)与(LVEDs)极显著降低(P<0.01),血清中CK-MB、LDH含量极显著减少(P<0.01),心脏功能增强;心肌细胞肿胀、凋亡、纤维增生减轻,心肌组织中PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达极显著升高(P<0.01),PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin被激活,凋亡蛋白Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3表达极显著降低(P<0.01),其中Que-H组治疗效果最佳。结论:Que具有一定的心肌保护作用,可通过激活PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin通路改善Dox引起的心肌损伤与凋亡。

基于ERK1/2-GSK3β-NFκB信号通路探究芪黄苁蓉通便散贴敷对肾衰竭大鼠肠道菌群及肾功能的影响

目的 研究基于细胞外信号调节激酶(ERK)1/2-糖原合成酶激酶(GSK)3β-核因子(NF)κB信号通路探究芪黄苁蓉通便散贴敷对肾衰竭大鼠肠道菌群及肾功能的影响。方法 40只SD大鼠随机抽取10只作为健康组进行对照,剩余建立慢性肾衰竭(CRF)模型,建模成功后分为模型组、治疗组(芪黄苁蓉通便散贴)、药物对照组(复元四红散)各10只。运用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肾功能、氧化应激相关指标水平,苏木素-伊红(HE)、Masson染色观察肾组织病理形态学,采集粪便检测肠道细菌种类及数量,Western印迹检测ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相关蛋白。结果 与健康组相比,模型组尿素氮、血肌酐、尿酸、丙二醛、肠球菌、肠杆菌、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3β、p-GSK3β、NFκBp65、p-NFκBp65、单核细胞趋化蛋白-1、细胞间黏附分子-1升高,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、双歧杆菌、乳酸杆菌水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,治疗组与药物对照组均有所改善,且以治疗组效果显著(P<0.05)。健康组肾组织结构正常;模型组肾小球变形,肾小管扩张,大量炎性细胞浸润;与模型组相比,治疗组与药物对照组均有所改善。Masson染色显示,健康组结构正常;模型组出现肾组织肾小管发生变性、萎缩、破坏及再生等病理改变,间质中单核与淋巴细胞浸润及胶原纤维表达最多;治疗组与药物对照组肾小管、间质的病理改变得到有效改善,蓝色胶原纤维沉积也呈下降趋势。结论 芪黄苁蓉通便散贴可能是通过抑制ERK1-2-GSK3β-NF-κB通路的激活,改善CRF大鼠肠道菌群及肾功能。

NEIL3调控AKT/GSK3β/Cyclin D1信号通路诱导肺腺癌细胞增殖

目的探讨NEIL3(Nei核酸内切酶VIII样蛋白3)在肺腺癌组织中的表达,明确其对肺腺癌细胞增殖的影响和分子机制。方法免疫组化检测肺腺癌组织NEIL3的表达,分析NEIL3表达与患者临床病理参数和生存预后的关系。采用short hairpin RNA(shRNA)慢病毒载体转染技术干扰肺腺癌细胞A549中NEIL3的表达后,平板克隆实验、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)实验和流式周期实验检测细胞增殖的改变;Western blot检测增殖相关分子Cyclin D1和信号通路AKT/GSK3β/β-catenin的改变。结果NEIL3表达与肺腺癌患者的临床分期、T分期及生存时间有关(P<0.05)。干扰NEIL3表达诱导A549细胞出现G0/G1期阻滞,抑制细胞增殖(P<0.05)。机制上,抑制NEIL3可促进Cyclin D1蛋白酶体降解从而下调其蛋白水平;干扰NEIL3可抑制AKT/GSK3β/β-catenin信号通路的激活(P<0.05)。结论NEIL3诱导肺腺癌细胞的增殖,机制可能与其调控AKT/GSK3β信号通路抑制Cyclin D1蛋白酶体降解有关。

PI3K/Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路促进神经细胞再生修复的研究进展

PI3K/Akt信号通路和Wnt/β-catenin信号通路通过活化多种效应分子,抑制细胞凋亡,促进细胞分裂增殖,在细胞存活方面发挥着重要作用。实验研究表明这两种信号通路在神经细胞凋亡和再生方面也起到关键作用,为以两种信号通路关键分子为靶点的研究提供有力参考和保证,特别是在目前广泛研究的脑缺血损伤与修复方面。

Wnt信号通路中β-catenin、GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的表达及其意义

目的研究Wnt信号通路相关因子β-catenin、GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的表达及意义。方法应用免疫组织化学En Vision法检测218例人卵巢组织(包括正常组织,卵巢良性腺瘤及腺癌组织标本)中β-catenin、GSK3β及Lef-1的表达情况。结果β-catenin、GSK3β及Lef-1在癌组织中的表达明显高于腺瘤及正常组织(P<0.05);β-catenin及Lef-1表达与淋巴结转移及FIGO分期有关(P<0.05),与肿瘤分级无关(P>0.05);GSK3β与肿瘤分级、淋巴结转移及FIGO分期有关(P<0.05);β-catenin、GSK3β及Lef-1三者在癌中的表达均与卵巢癌的类型无关(P>0.05)。β-catenin表达与GSK3β和Lef-1表达均呈正相关(P<0.05)。结论 Wnt信号通路中β-catenin、GSK3β及LEF-1在卵巢癌的发生发展过程中起了一定的作用,卵巢癌的进展可能和β-catenin分别与GSK3β及LEF-1共同作用促进细胞的增殖有关,三者高表达与卵巢癌的预后有关。

青蒿琥酯对人源肝星状细胞中Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路的影响研究

目的:探讨青蒿琥酯(Art)对Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路的影响。方法:不同浓度(0,12.5,25,50μg·ml^(-1))Art作用于人源肝星状细胞(LX-2),采用CCK-8法检测细胞增殖情况,并确定给药浓度;给予不同浓度Akt抑制药MK-2206 0~8μmol·L^(-1),Western blot法确定其最佳抑制浓度;给予Art、MK-2206、MK-2206+Art,采用Western blot法检测各组Akt、pAkt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达情况。结果:CCK-8法检测细胞存活率,当选用25μg·ml^(-1)Art作用于LX-2细胞24h时细胞存活率约80%,Western blot法确定当MK-2206浓度为6μmol·L^(-1)时,可有效抑制p-Akt的表达;Art组(25μg·ml^(-1))、MK-2206组(6μmol·L^(-1))、MK-2206(6μmol·L^(-1))+Art(25μg·ml^(-1))组与对照组相比,Akt、p-Akt、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达均有显著差异(P<0.05),MK-2206(6μmol·L^(-1))+Art(25μg·ml^(-1))组分别与Art(25μg·ml^(-1))组、MK-2206(6μmol·L^(-1))组比较,GSK-3β、Akt蛋白表达无显著差异(P>0.05),p-Akt、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:Art可通过Akt因子对Wnt/β-catenin信号通路中相关因子产生影响,进而抑制细胞增殖,缓解肝纤维发展进程。

异橙黄酮通过AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路诱导胃癌AGS细胞凋亡和周期阻滞研究

目的:探讨异橙黄酮对胃癌细胞AGS增殖、凋亡和周期的影响及相关作用机制。方法:用2.5,5和10μmol·L^(-1);的异橙黄酮处理胃癌AGS细胞,另设阴性对照组,加入等体积的DMSO。应用CCK-8、EDU和流式细胞数检测各组AGS细胞增殖、凋亡和周期情况;分子对接技术明确异橙黄酮的可能作用靶点;Western blot检测各组AGS细胞中蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化糖原合酶激酶3β(9号丝氨酸位点)[p-GSK-3β(ser9)]、β-连环蛋白(β-catenin)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X调控因子(Bax)、半胱天冬酶-8剪切体(cleave-caspase-8)、周期素依赖性激酶4(CDK4)和周期素依赖性激酶6(CDK6)的表达。以10μmol·L^(-1);的异橙黄酮、10μmol·L^(-1);的异橙黄酮联合10μmol·L^(-1);AKT激动剂SC79以及等体积的DMSO(对照)处理胃癌AGS细胞,应用Western blot检测AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β(ser9)和β-catenin的表达,以及应用CCK-8、EDU和流式细胞数检测各组AGS细胞增殖、凋亡和周期情况。结果:与阴性对照组相比,2.5,5和10μmol·L^(-1);异橙黄酮处理组AGS细胞增殖均明显减弱,凋亡率均明显增加,显著阻滞在G1期(P<0.05或P<0.01),异橙黄酮能与AKT的活性口袋稳定结合,显著减少胃癌AGS细胞中p-AKT、p-GSK-3β(ser9)、β-catenin、Bcl-2、CDK4和CDK6的表达以及增加Bax和cleave-caspase-8的表达(P<0.05或P<0.01)。与10μmol·L^(-1);的异橙黄酮处理组相比,10μmol·L^(-1);的异橙黄酮联合10μmol·L^(-1);的AKT激动剂SC79处理组细胞p-AKT、p-GSK-3β(ser9)和β-catenin的表达显著增加,细胞增殖率明显增加,凋亡率明显减少,且G1期细胞阻滞程度明显减弱(P<0.05或P<0.01)。结论:异橙黄酮可能通过AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路抑制AGS细胞的增殖以及诱导其凋亡和周期阻滞。

低频脉冲电磁场通过PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号途径促进成骨细胞矿化成熟

低频脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields,PEMFs)可以促进体外培养大鼠颅骨成骨细胞(rat calarial osteoblasts,ROB)的矿化成熟,但其具体机制尚不清楚。本实验主要研究PEMFs促进大鼠成骨细胞成熟矿化与PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路的关系,以PEMFs促进成骨细胞成熟矿化的机制。首先,将成骨细胞经不同强度PEMFs处理后检测胞内碱性磷酸酶(ALP)活性的变化,以探明PEMFs促进成骨分化的最佳磁场强度;接着,采用蛋白质印迹法检测PEMFs处理不同时间后细胞内PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、β-联蛋白的变化情况;最后,细胞经PI3K特异性阻断剂处理后,检测ALP活性变化、钙盐沉积情况、成骨性相关基因RUNX2、BMP2表达量,以及BMP2/Smad1/5/8信号途径的变化情况,同时也检测了该条信号途径下游蛋白质表达量及相关转录因子的核易位情况。结果发现,磁场强度为0.6 mT时,ALP活性最高;PEMFs处理成骨细胞不同时间后,PI3K、AKT和GSK3β总蛋白质无明显变化,但是p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β、β-联蛋白的表达量较对照组显著升高,同时β-联蛋白发生核易位;经过PEMFs处理的成骨细胞的ALP活性显著升高,成骨性相关基因表达量明显增加,钙盐沉积能力增强,BMP2/Smad1/5/8信号途径被激活;在加入PI3K特异性阻断剂后,PEMFs促进成骨细胞矿化成熟的能力消失,并且不再提高该条信号途径下游蛋白质的表达和相关转录因子的核转位。上述结果提示,0.6 mT PEMFs促进成骨分化的此过程中激活了PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号通路,若该条信号通路被抑制,则电磁场促成骨作用被抵消,表明低频脉冲电磁场促进成骨细胞矿化成熟依赖于PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin信号途径,这为采用脉冲电磁场治疗骨质疏松症提供了理论基础。

miR-199a通过Wnt3a/β-catenin信号通路调控非小细胞肺癌细胞的生物学活动

目的探讨miR-199a调控非小细胞肺癌A549细胞的增殖、凋亡、转移和侵袭等生物学功能及作用机制。方法RT-PCR检测正常肺上皮细胞BEAS-2B和非小细胞肺癌细胞A549内miR-199a的表达;分别用miR-199a-mimics、miR-199a-NC和miR-199a-inhibitor转染至A549细胞内,转染48 h后CCK-8法检测细胞各组细胞增殖率,Annexin V-FITC/PI联合流式细胞仪检测细胞凋亡率,划痕实验和Transwell小室实验分别检测细胞迁移、侵袭能力,采用双荧光素酶报告实验验证Wnt3a与miR-199a的靶向关系,Western blot检测Wnt3a、β-catenin、C-myc、Survivin、E-cadherin、Vimentin蛋白表达。结果miR-199a在肺癌细胞中的表达低于正常肺上皮细胞(P<0.05);miR-199a-mimics组细胞增殖、迁移、侵袭活性显著低于其他两组(P<0.05),而凋亡率显著高于其他两组(P<0.05),miR-199a-inhibitor组细胞增殖、迁移、侵袭活性显著高于其他两组(P<0.05),而凋亡率显著低于其他两组(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-199a靶向抑制A549细胞中Wnt3a的表达;miR-199a-mimics组细胞Wnt3a、β-catenin、C-myc、Survivin、Vimentin蛋白表达显著低于其他两组(P<0.05),而E-cadherin表达在3组中最强(P<0.05),miR-199a-inhibitor组细胞Wnt3a、β-catenin、C-myc、Survivin、Vimentin蛋白表达显著高于其他两组(P<0.05),而E-cadherin表达在3组中最弱(P<0.05)。结论miR-199a能抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭,同时刺激其凋亡,这种作用是通过靶向抑制Wnt3a/β-catenin信号通路的活性而实现的。