In-fusion技术构建表达、纯化钠泵α3亚单位膜外区截断性片段重组质粒

目的构建重组pGEX-6P-1原核表达载体，表达和纯化大鼠钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区的截断性片段。方法利用In-fusion技术将钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区基因片段插入线性化的pGEX-6P-1载体中，转化，提取质粒，PCR鉴定；用阳性重组质粒pGEX-Trf-α3转化大肠杆菌，IPTG诱导、表达融合蛋白GST—Trf-α3。采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白，SDS-PAGE电泳分析表达产物的可溶性及含量。采用放射性配体结合法检测其生物活性。结果PCR和基因测序分析显示大鼠钠泵a3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区被成功插入pGEX-6P-1载体GST基因3’端，蛋白序列分析表明GsT-Trf-α3融合蛋白总长度262个氨基酸，理论相对分子质量应约为33．22×10^3。IPTG诱导后，GST-Trf-α3融合蛋白的表达量为10％，多以可溶性形式存在，可溶性蛋白表达量为80．8％。SDS-PAGE结果显示其纯度〉95％。生物活性实验结果显示GST—Trf-α3融合蛋白与^3H-哇巴因具有一定的结合能力，但结合能力较弱。结论采用In-fusion技术成功构建了表达GST-Trf-α3融合蛋白的原核表达载体，建立了纯化方法，获得高纯度的融合蛋白，为钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区功能以及其潜在的药理学作用研究获得了实验数据。

细胞凋亡过程中核糖体蛋白质S3a水平变化的研究(二)——制备和纯化抗GST/S3a多克隆抗体

目的:制备和纯化抗GST/S3a多克隆抗体。方法:盐析法粗提抗体,用蛋白A-琼脂糖柱纯化IgG,ELISA法检测多克隆抗体水平。结果:ELISA法测定制备和纯化抗GST/S3a多克隆抗体的活性正常,产生了抗原-抗体反应复合物。结论:制备和纯化的抗体血清可以与GST/S3a融合蛋白相结合,产生抗原-抗体反应复合物,说明具有抗GST/S3a融合蛋白的活性。为下一步实验奠定基础。

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST p16融合蛋白。方法 以质粒pM p16为模板 ,扩增出p16基因片段 ,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX 6P 1,将所构建的重组质粒pGEX p16转化大肠杆菌BL2 1并诱导表达 ,采用GST蛋白纯化系统进行纯化 ,所得产物进行SDS PAGE及Westernblot鉴定。结果 大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约 4 2kD蛋白 ,其分子量与GST p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16抗体特异性识别。结论 本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST

细胞凋亡过程中核糖体蛋白质S3a水平变化的研究(三)──检测细胞凋亡过程中RPS3a水平的变化

目的：检测细胞凋亡过程中ＲＰＳ３ａ水平的变化，探讨ＲＰＳ３ａ在细胞凋亡中的作用。方法：用放射菌素Ｄ（Ａｃｔ Ｄ）诱导ＨＬ－６０细胞发生凋亡，应用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法检测细胞凋亡过程中ＲＰＳ３ａ水平的变化。结果：ＨＬ－６０细胞在诱发凋亡１小时后，ＲＰＳ３ａ的水平与对照组比较显著升高，之后迅速降低，在诱导２ｈ时其水平已低于正常对照组的水平，并随时间推移逐渐降低，在细胞凋亡的晚期，即诱导６ｈ时，ＲＰＳ３ａ已降至不可检测的水平。结论：ＲＰＳ３ａ水平出现的一过性增高随后迅速降低，这可能是发挥其核糖体外的功能，作为信号诱导细胞凋亡；在细胞凋亡的早期ＲＰＳ３ａ的不可逆性降解致使核糖体的完整性丧失，从而抑制蛋白质的合成，最终导致细胞凋亡。

转录因子AP-2α与ACTN1、TES的相互作用

AP-2α是转录因子AP-2家族中的重要一员,与发育和细胞生长、分化和凋亡都有密切的联系.本文用酵母双杂交的方法筛选得到两个与转录因子AP-2α相互作用的蛋白,经测序鉴定分别为ACTN1与TES基因.在先前对AP-2α与TES基因分别克隆并在表达的基础上,进一步克隆并表达了ACTN1基因,并证实了ACTN1蛋白与AP-2α能够在体外相互作用.而且免疫共沉淀的结果表明在HeLa细胞系中过表达的AP-2α与TES蛋白能够处于同一复合体中.同时发现HeLa细胞系中,内源表达的ACTN1蛋白与GFP-TES有明显的共定位.结果提示这3种蛋白可能存在于同一个大的复合体中,通过这样的结合完成复杂的调节功能.

转录激活因子AP-2β基因的克隆、表达及其抗体的制备(英文)

目的 :克隆、表达与纯化出AP - 2 β蛋白质 ,并用所表达的蛋白质制备出抗AP - 2 β的抗体。方法 :将AP- 2 β基因插入到表达载体 pGEX - 4T - 1谷胱苷肽 -S -转移酶基因下游 ,所得克隆经测序 ,以确定其阅读框码的正确性 ,然后用正确的克隆质粒转化E .coliBL2 1,用异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,而后用谷胱苷肽琼脂糖 - 4B纯化所表达的融合蛋白质。通过凝胶迁移率变动分析实验 (EMSA)测得蛋白质的生物学活性 ,所得蛋白质用于制备抗体。结果 :得到一条大约 78KD的蛋白质 ,并且成功的制备了抗体 ,所得蛋白质和抗体均具有很好的生物学活性。结论 :我们成功的表达出转录激活因子AP - 2 β并制备出抗AP - 2 β的抗体 ,为一下步对AP - 2 β的功能进行研究打下了良好的基础。