磁性纳米吸附剂对GST-tagged蛋白的分离纯化

本文以Fe_3O_4/半胱氨酸(以Fe_3O_4/Cys)为载体,通过在其表面修饰功能化的谷胱甘肽(GSH)基团,得到Fe_3O_4/Cys-GSH纳米吸附剂,可直接应用于谷胱甘肽S-转移酶标记(GST-tagged)融合蛋白的亲和分离.实验结果表明,制备的Fe_3O_4/Cys-GSH纳米吸附剂对GST-tagged融合蛋白具有特异性、普适性、重复利用性能,可实现对目标蛋白的快速、高效分离,具有潜在的市场应用价值.

GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签

利用基因工程的方法,以实验室保存的p MAL-C2X-NAP质粒为模板,PCR扩增NAP基因,构建重组质粒p GEX-NAP.重组质粒通过酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),再经IPTG低温诱导获得可溶性GST-NAP融合蛋白,最后利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂进行纯化,Prescission蛋白酶进行柱上切割去除GST标签.结果表明,p GEX-NAP重组质粒构建正确,在大肠杆菌中经IPTG低温诱导表达,可获得大量可溶性GST-NAP融合蛋白.Prescission蛋白酶柱上切割去除GST标签后,经Western Blot验证NAP蛋白能被兔抗NAP多克隆抗体特异识别.

幽门杆菌Catalase/GST融合蛋白的表达、标签切除及鉴定

旨在利用GST融合基因表达系统表达幽门螺杆菌Catalase融合蛋白,并利用凝血酶切除GST标签。将重组质粒Catalase/pGEX-4T-1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,用IPTG进行诱导表达,菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌后,Catalase/GST融合蛋白以部分可溶性的形式表达在上清中。采用谷胱甘肽琼脂糖树脂Glutathione Sepharose 4B对其进行纯化,得到Catalase/GST融合蛋白,再用凝血酶进行GST标签的切除,所得产物进行Western blotting鉴定。高效表达出Catalase/GST融合蛋白的相对分子质量约85 kD,凝血酶成功地切除了GST标签,Western blotting证实Catalase蛋白能被鼠抗Catalase单克隆抗体识别。

GST-β-catenin-His双标签融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

应用RT-PCR技术扩增β-catenin的cDNA序列,并且在基因下游引入6×His标签序列,克隆至表达载体pGEX-4T-1.经测序鉴定后,将重组质粒转入BL21pLysS感受态细菌,经IPTG诱导表达,采用Glutathione Sepharose 4B和Ni柱分步纯化GST-β-catenin-His融合蛋白.所得产物经SDS-PAGE检测,在114 kDa处显示特异条带,与GST-β-catenin-His融合蛋白预期分子量相符.经Western Blotting鉴定,所纯化蛋白能被β-catenin抗体、GST抗体和His抗体识别,为进一步研究β-catenin的功能提供了基础和前提.

野生型和失活型PAK1基因自我抑制域的GST标签真核表达载体的构建及表达

目的:构建不同活性的人p21活化激酶1(hPAK1)自我抑制域(AID)谷胱甘肽(GST)标签真核表达载体并鉴定其融合蛋白表达,以探讨PAK1AID的功能及肿瘤治疗的靶向意义。方法:以pcDNA3.1HisC-PAK1全长质粒为模板,利用PCR扩增野生型(WT)PAK1AID片段,再以此片段为模板采用大引物法扩增其突变体L107F片段,双酶切克隆至GST融合的真核表达载体pEBG。将质粒转染至工具细胞HEK293中,并经免疫印迹鉴定GST融合蛋白的表达。结果:PCR扩增出约200bp大小的野生型和失活型PAK1AID片段,双酶切得到与预期大小相符的载体与PAK1AID片段,野生型与失活型pEBG-PAK1在工具细胞HEK293中表达,蛋白的相对分子质量均为33 000。结论:成功构建野生型和失活型PAK1基因AID的GST标签真核表达载体,并表达出不同活性的GST-PAK1AID的融合蛋白。

GST-His-Heparinase Ⅰ双标签融合蛋白的原核表达与纯化

以pET15b-HepⅠ为模板,通过PCR技术扩增出上游合有6×His标签的HepⅠ基因序列,克隆至表达载体pGEX-4T-1。测序鉴定后,将重组表达质粒pGEX-His-HepⅠ转入E.coli BL21(DE3)感受态细菌,经IPTG诱导表达。表达产物可溶部分用GSTrap FF和HisTrap HP柱两步亲和纯化,所得产物经SDS-PAGE检测,在66 kDa和43 kDa处显示特异条带,分别与GST-His-HepⅠ和His-HepⅠ融合蛋白预期分子量相符;最终His-HepⅠ融合蛋白的比酶活为86.45 IU/mg,纯度高达99%,与仅一步亲和纯化得到的GST-His-HepⅠ融合蛋白相比,进一步提高了纯化后重组肝素酶的纯度。本研究为制备高纯度的HepⅠ提供了一种方法,对制备高安全性的LMwH和解析HepⅠ晶体结构具有重要意义。

切除GST标签的重组蛋氨酸酶及多抗制备

目的优化表达条件后纯化出切除GST标签的Met-PGEX-4T-1蛋白,制备出假单胞菌来源的多克隆抗体.方法将蛋氨酸酶(L-methionine gamma-lyase,Me)t的基因克隆至pBSK载体中,形成重组质粒pBSK-Met,采用基因工程技术将pBSK-Met与PGEX-4T-1载体连接,形成Met-PGEX.利用大肠杆菌表达系统诱导表达出Met-PGEX,采用亲和层析法过柱纯化Met-PGEX,凝血酶切除分子量为26KD的GST标签,免疫新西兰兔制备出蛋氨酸酶多克隆抗体Met PcAb,双向免疫扩散实验测多克隆抗体效价为1:128,间接Elisa法测效价1:1×105.结果成功表达纯化出纯度大于90%的Met-PGEX并制备出多克隆抗体.结论所制备的多克隆抗体可用于检测不同来源重组蛋氨酸酶抗原差异性变化.

GST-His双标签原核表达载体的构建及应用

目的:在原有带有GST标签的pGEX-KG载体上添加His标签,构建双标签原核表达载体,以提高纯化后的融合蛋白的纯度。方法:双酶切pGEX-KG载体,将同样带有双酶切位点编码His标签的DNA序列酶切后与其连接、转化大肠杆菌DH5α、鉴定阳性克隆并测序,并将编码雌激素受体β(ERβ)的片段构建到该载体上,分别利用GST标签和His标签对ERβ蛋白进行2次纯化。结果:构建了GST-His双标签原核表达载体,将ERβ编码片段克隆入该载体中,在原核生物中得到表达;分别用GST和His抗体进行Western blot分析,均可检测到GST-His-ERβ融合蛋白的表达;利用此双标签载体纯化得到了纯度较高的ERβ蛋白。结论:GST-His双标签原核表达载体的构建对提高目的蛋白纯度具有重要意义。

伪狂犬病病毒EP0基因的克隆及原核表达

为研究伪狂犬病病毒EP0蛋白与病毒粒子中其他蛋白的相互作用,应用PCR方法从伪狂犬病病毒基因组中扩增EP0基因的编码区并克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-EP0;用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pMD-EP0,回收EP0基因,并将其亚克隆至pGEX-4T-1中,构建带有GST标签的重组质粒pGEX-EP0;重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blot检测其表达情况。结果表明,扩增到EP0基因的编码区序列大小为1 227bp;重组表达菌经诱导后,EP0融合蛋白获得了表达,大小约71.4ku,且能与伪狂犬病病毒EP0单克隆抗体发生特异性反应。该蛋白的成功表达为进一步研究EP0蛋白与宿主细胞及病毒粒子中其他蛋白的相互作用奠定了基础。

马铃薯转录因子基因StWRKY57的克隆及其蛋白原核表达

为了研究马铃薯WRKY57基因(PGSC transcript number PGSC0003DMT400072958)功能,通过RT-PCR克隆得到马铃薯耐旱品种PB06的StWRKY57基因cDNA序列,命名为StWRKY57-PB。利用生物信息学方法对其序列特征进行了分析;以pGEX-KG为基本骨架,构建了StWRKY57-PB蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌中进行了表达和纯化分析。结果表明,StWRKY57-PB基因开放阅读框(ORF)长981 bp,编码蛋白属于WRKY转录因子家族Ⅱc类,含326个氨基酸残基,含有WRKY结构域(WRKYGQK)和一个类锌指结构基序(C-X_(4)-C-X_(23)-H-X_(1)-H)。序列比对及构建系统发育树结果表明,它与马铃薯基因组数据库及NCBI公布的WRKY57(XP_006348711.1)有4个氨基酸的差异,与番茄WRKY57分子距离较近,相似性为93%,与拟南芥WRKY57亲缘关系较远,相似性为57%。二级结构预测发现,StWRKY57-PB所编码蛋白由延伸链、α螺旋、β折叠和不规则卷曲组成,四者比例分别为13.50%,16.56%,7.98%,61.96%。在0.5 mmol/L IPTG诱导下,该蛋白质在3种大肠杆菌表达菌株BL21、Rosetta和Tuner中稳定表达,利用GST亲和树脂分离纯化了GST-StWRKY57-PB融合蛋白,Western Blot验证了蛋白质的表达和纯化。对进一步确定该蛋白质的体外活性及生物学功能具有重要意义。

拟南芥IAA7的原核表达及稳定性分析

以p GEX–KG为基本骨架,构建了拟南芥IAA7蛋白的原核表达载体,用IPTG诱导IAA7在3种大肠杆菌表达菌株Rosetta、BL21和Tuner中表达,利用GST SefiroseTM resin亲和树脂分离纯化GST–IAA7融合蛋白,并分析重组蛋白在体外保存时的稳定性。结果表明:GST–IAA7融合蛋白在Rosetta菌株中于25℃和0.4 mmol/L IPTG诱导下表达较好;蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)可显著延长GST–IAA7在体外保存的时间,最后利用凝血酶切除GST标签后获得了纯化的IAA7蛋白质。

水稻VDAC3蛋白的可溶性外源表达及纯化

[目的]获得外源表达的可溶性水稻VDAC3蛋白。[方法]将osvdac3基因克隆到含有GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体中,转化入BL21表达菌株,经IPTG诱导,并使用SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物,通过Glutathione Resin亲和层析系统纯化获得较纯的目的蛋白。[结果]试验成功构建了pGEX-4T-1-osvdac3原核表达载体并转化大肠杆菌。通过SDS-PAGE和Western Blot试验证实56 kD处的蛋白条带是具有可溶性表达的VDAC3蛋白。[结论]经Glutathione Resin亲和层析系统纯化得到可溶性带GST标签的VDAC3蛋白。该研究结果为水稻VDAC蛋白的功能研究进一步奠定了基础。

TIA抗原基因原核表达载体的构建及表达

目的:克隆并构建短暂性脑缺血发作重组cDNA表达克隆血清学鉴定技术(SEREX)抗原基因原核表达载体,重组GST融合蛋白.方法:采用SEREX筛选所获的70个重组cDNA克隆pBluescript质粒,用限制性内切酶(EcoRⅠ/XhoⅠ、BamHⅠ/XhoⅠ或SmaⅠ/XhoⅠ)双酶切,用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳分离回收目的基因片段.应用Ligation和In-Fusion基因重组技术,将目的基因插入原核表达载体质粒pGEX-4T-1,2,3,转化表达菌株E.coli BL-21感受态细胞,并用IPTG诱导GST标签蛋白表达,通过SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,再经酶切及DNA测序鉴定,成功重组pGEX-4T载体的插入片段可以作为候选靶抗原.结果:成功获得21个重组pGEX-4T载体的靶抗原目的基因,均能够在原核表达系统中成功表达GST融合目的蛋白.结论:应用Ligation和In-Fusion基因重组技术能够有效构建原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组融合目的蛋白.

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆及原核表达

根据Gen Bank中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)基因组序列设计引物,利用PCR技术扩增了植物乳杆菌QL-14的谷氨酸脱羧酶编码基因gad B,克隆至表达载体p GEX-4T-3,转化大肠杆菌(Escherichia coli)后进行原核表达,对表达条件进行了优化并对表达蛋白质进了纯化。结果表明,扩增目的gad B基因的开放阅读框(ORF)全长1 407 bp,编码469个氨基酸,氨基酸序列与植物乳杆菌WCFS1同源性为99.6%。通过优化诱导表达条件,得到纯化蛋白质GAD大小为53.6 ku,等电点为5.58,比活力为9.9 U/mg。

猪表皮生长因子的原核表达及纯化

[目的]:提高重组猪表皮生长因子(pEGF)的表达量和纯化量,为后续研究pEGF对仔猪生长发育的影响奠定基础。[方法]:将人工合成的pEGF基因克隆至pEGF4T-1载体,转化至大肠杆菌Rossetta(DE3)中,得到重组菌株Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF,IPTG诱导表达,进行表达条件的优化,用GST-tag亲和层析纯化方法进行纯化。[结果]:pEGF基因大小为159 bp,融合表达蛋白分子量为32k Da,最佳诱导表达条件为IPTG浓度0.01mmol/L、诱导温度15℃和诱导时间24h。流穿液和洗涤液中目的蛋白含量极少,洗脱液得到了高纯度的GST-pEGF融合蛋白,纯化较为成功。[结论]:成功构建了pEGF表达菌株,得到了最优的诱导表达条件和最优的纯化工艺,为pEGF相关产品的开发以及应用奠定了基础。

柱上切除GST标签制备幽门螺杆菌Lpp20蛋白

目的表达幽门螺杆菌Lpp20-GST融合蛋白,获取切除GST标签的重组蛋白。方法采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组表达质粒Lpp20/pGEX-4T-1在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,收集菌体并采用反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌3种细胞破碎方法,表达产物在谷胱甘肽琼脂糖树脂4B柱上纯化,利用凝血酶切除GST标签,用鼠抗Lpp20单克隆抗体进行纯化产物western blot鉴定。结果高效表达出Lpp20-GST融合蛋白,相对分子质量约为4.5 kDa,产物以部分可溶性形式表达,凝血酶成功切除GST标签,纯化产物能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别。结论凝血酶柱上切除GST标签获得目的蛋白。

丝氨酸类蛋白酶对GST-Cry3Aa融合表达蛋白酶解活化分析

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的Cry3Aa毒素在许多鞘翅目害虫的防治中发挥了重要作用。随着昆虫抗性的产生,如何通过大肠杆菌高通量表达筛选cry3Aa基因改造突变蛋白成为了研究的重点。然而,cry3Aa基因在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达后其蛋白酶活化效果及杀虫活性均受到一定程度影响,对于影响的程度仍知之甚少。为探索cry3Aa基因所表达的融合蛋白GST-Cry3Aa中GST标签对Cry蛋白结构和功能的影响,本研究通过利用丝氨酸类蛋白酶(胰蛋白酶,糜蛋白酶)对纯化后的Cry3Aa融合蛋白进行水解条件研究分析,结果表明:在温度为11~37℃、GST-Cry3Aa与胰蛋白酶的质量比为4:1~30:1时,均可被水解出约55 k D的活性片段,而在同样条件下糜蛋白酶则无法对GST-Cry3Aa进行有效的水解活化。此外,结合I-TASSER和Swiss model对Cry3Aa与GST-Cry3Aa进行三维结构分析比对,发现GST-Cry3Aa在其结构域Ⅰ内有部分改变,推测其可能为两种丝氨酸类蛋白酶对该融合蛋白水解效果产生差异的原因。为后期构建Cry3Aa毒素高通量分子改造平台提供了理论基础。

幽门螺杆菌Lpp20融合蛋白的表达、标签切除及鉴定

目的:利用GST融合基因表达系统表达Lpp20-GST融合蛋白,并利用凝血酶切除GST标签。方法:IPTG诱导重组质粒Lpp20/pGEX-4T-1在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌后,发现Lpp20-GST融合蛋白以部分可溶性的形式表达。采用GST蛋白纯化系统对其纯化,得到Lpp20-GST融合蛋白,再用凝血酶进行GST标签的切除,所得产物进行Western Blot鉴定。结果:高效表达出Lpp20-GST融合蛋白的相对分子质量约4.5kDa,凝血酶成功切除了GST标签,Western Blot证实Lpp20蛋白能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别。结论:成功表达和纯化了重组Lpp20蛋白,为深入研究Lpp20的功能奠定了基础。

风疹病毒多表位诊断抗原的制备与评价

原核表达与层析纯化获取风疹病毒（Rubella Virus,RV）多表位诊断抗原,并初步评价其抗原性。将RV衣壳蛋白C aa 3～29、aa 96～123以及包膜糖蛋白E1aa208～247三个主要免疫显性表位串联,密码子优化后全基因合成;利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有GST标签的表达质粒中,在大肠杆菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western Blot（WB）技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立RV-IgM抗体检测ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。获取高度均质的RV多表位诊断抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被anti-GST单克隆抗体识别,还可以被anti-RV多克隆抗体、RV-IgM阳性血清相应抗体所识别。分别对48份RV急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的RV多表位诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于RV-IgM ELISA血清学检测中。

量子点功能化二氧化硅纳米微球的制备及其对蛋白质的亲和分离

采用液相沉淀法合成ZnS量子点,将多孔纳米二氧化硅(SiO_2)微球与ZnS量子点复合形成ZnS/SiO_2复合微球,随后在该微球表面修饰谷胱甘肽基团(-GSH基团),形成生物功能化的ZnS/SiO_2-GSH复合微球,该微球平均粒径100nm,粒径均一,分散性好,从透射电镜图可以看出,微球表面负载了一层ZnS,厚度约2nm.制备的ZnS/SiO_2-GSH微球可以从混合蛋白中直接分离纯化谷胱甘肽S-转移酶为标签的(GST-tagged)融合蛋白,电泳结果显示,该复合微球能够特异性地分离目标蛋白,分离效果良好,并具有良好的重复利用性,具有潜在的市场应用价值.