GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签

利用基因工程的方法,以实验室保存的p MAL-C2X-NAP质粒为模板,PCR扩增NAP基因,构建重组质粒p GEX-NAP.重组质粒通过酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),再经IPTG低温诱导获得可溶性GST-NAP融合蛋白,最后利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂进行纯化,Prescission蛋白酶进行柱上切割去除GST标签.结果表明,p GEX-NAP重组质粒构建正确,在大肠杆菌中经IPTG低温诱导表达,可获得大量可溶性GST-NAP融合蛋白.Prescission蛋白酶柱上切割去除GST标签后,经Western Blot验证NAP蛋白能被兔抗NAP多克隆抗体特异识别.

拟南芥IAA7的原核表达及稳定性分析

以p GEX–KG为基本骨架,构建了拟南芥IAA7蛋白的原核表达载体,用IPTG诱导IAA7在3种大肠杆菌表达菌株Rosetta、BL21和Tuner中表达,利用GST SefiroseTM resin亲和树脂分离纯化GST–IAA7融合蛋白,并分析重组蛋白在体外保存时的稳定性。结果表明:GST–IAA7融合蛋白在Rosetta菌株中于25℃和0.4 mmol/L IPTG诱导下表达较好;蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)可显著延长GST–IAA7在体外保存的时间,最后利用凝血酶切除GST标签后获得了纯化的IAA7蛋白质。

TIA抗原基因原核表达载体的构建及表达

目的:克隆并构建短暂性脑缺血发作重组cDNA表达克隆血清学鉴定技术(SEREX)抗原基因原核表达载体,重组GST融合蛋白.方法:采用SEREX筛选所获的70个重组cDNA克隆pBluescript质粒,用限制性内切酶(EcoRⅠ/XhoⅠ、BamHⅠ/XhoⅠ或SmaⅠ/XhoⅠ)双酶切,用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳分离回收目的基因片段.应用Ligation和In-Fusion基因重组技术,将目的基因插入原核表达载体质粒pGEX-4T-1,2,3,转化表达菌株E.coli BL-21感受态细胞,并用IPTG诱导GST标签蛋白表达,通过SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,再经酶切及DNA测序鉴定,成功重组pGEX-4T载体的插入片段可以作为候选靶抗原.结果:成功获得21个重组pGEX-4T载体的靶抗原目的基因,均能够在原核表达系统中成功表达GST融合目的蛋白.结论:应用Ligation和In-Fusion基因重组技术能够有效构建原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组融合目的蛋白.

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆及原核表达

根据Gen Bank中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)基因组序列设计引物,利用PCR技术扩增了植物乳杆菌QL-14的谷氨酸脱羧酶编码基因gad B,克隆至表达载体p GEX-4T-3,转化大肠杆菌(Escherichia coli)后进行原核表达,对表达条件进行了优化并对表达蛋白质进了纯化。结果表明,扩增目的gad B基因的开放阅读框(ORF)全长1 407 bp,编码469个氨基酸,氨基酸序列与植物乳杆菌WCFS1同源性为99.6%。通过优化诱导表达条件,得到纯化蛋白质GAD大小为53.6 ku,等电点为5.58,比活力为9.9 U/mg。

猪表皮生长因子的原核表达及纯化

[目的]:提高重组猪表皮生长因子(pEGF)的表达量和纯化量,为后续研究pEGF对仔猪生长发育的影响奠定基础。[方法]:将人工合成的pEGF基因克隆至pEGF4T-1载体,转化至大肠杆菌Rossetta(DE3)中,得到重组菌株Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF,IPTG诱导表达,进行表达条件的优化,用GST-tag亲和层析纯化方法进行纯化。[结果]:pEGF基因大小为159 bp,融合表达蛋白分子量为32k Da,最佳诱导表达条件为IPTG浓度0.01mmol/L、诱导温度15℃和诱导时间24h。流穿液和洗涤液中目的蛋白含量极少,洗脱液得到了高纯度的GST-pEGF融合蛋白,纯化较为成功。[结论]:成功构建了pEGF表达菌株,得到了最优的诱导表达条件和最优的纯化工艺,为pEGF相关产品的开发以及应用奠定了基础。

鼠伤寒沙门菌延伸因子EF-Tu蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备鼠伤寒沙门菌延伸因子Tu(EF-Tu)的单克隆抗体,以原核表达并纯化的鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与SP2/0融合,以间接ELISA筛选出阳性克隆,经5次亚克隆后获得5株稳定分泌抗EF-Tu蛋白抗体的杂交瘤细胞株,遂将其命名为Tu1-A1、Tu1-C4、Tu1-H2、Tu4-C11、Tu9-B9。对这5株单克隆抗体的初步鉴定结果表明,其抗体亚型均为IgG1/κ型。以原核表达的带GST标签的EF-Tu蛋白做Western-blot检测制备的单克隆抗体,证实所制备的单克隆抗体具有良好的反应性。这些单克隆抗体的制备为后期研究EF-Tu蛋白在沙门菌侵入及胞内存活过程中的调控作用奠定了基础。