细胞凋亡过程中核糖体蛋白质S3a水平变化的研究(一)──应用GST基因融合蛋白系统制备核糖体蛋白质S3a(RPS3a)

目的：应用GST基因融合蛋白系统制备核糖体蛋白质S3a(RPS3a)。方法：将S3a cDNA序列插入到pGEX-4T-2质粒中，制备GST/S3a融合蛋白及其抗体。结果：S3a cDNA序列在Xho I位点上插入到pGEX-4T-2质粒中，形成重组的pGEX-4T-2/S3a质粒。结论：pGEX-4T-2质粒编码GST蛋白基因，在IPTG的诱导下可以表达GST/S3a融合蛋白。为下一步实验奠定了基础。

GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究

将构建好的可表达GST融合蛋白的重组病毒AcMNPV OCC- GST 6xHis Etp2 8感染Sf9细胞 ,一定时间后取感染了病毒的细胞裂解物上清液进行SDS PAGE分析 ,结果显示 5 3kDa的融合蛋白 (GST 6xHis Etp2 8)呈不溶状态。在原有裂解液的基础上 ,加固体十二烷基肌氨酸钠至终浓度 1.5 % ,并将TritonX 10 0的比例由 1%提高到 2 %。SDS PAGE结果显示至少有 1/ 3的GST 6xHis Etp2 8处于溶解状态 ,可溶性GST 6xHis Etp2 8经亲合层析 ,5

TAP系统分离纯化MT1-MMP-hTAP融合基因蛋白复合物及表达效应评估

目的 应用TAP系统分离纯化的MT1 MMP hTAP蛋白复合物的表达效应。方法 应用TAP系统分子生物学特性采用IgG和钙调蛋白亲和胶粒二次亲和层析法分离纯化MT1 MMP hTAP蛋白复合物。PAP免疫染色及Westernblot法检测蛋白表达效应。结果 PAP免疫染色显示MT1 MMP hTAP融合基因在鸡成纤维细胞内有效表达 ,融合蛋白染色呈深蓝色 ,Westernblot法检测经TAP系统分离纯化后MT1 MMP hTAP蛋白复合物分子稳定表达在相应 68× 10 3 位置。结论 TAP系统分离纯化MT1 MMP hTAP蛋白复合物及其在动物细胞的构建成功并有效表达为在人类肿瘤细胞建立TAP纯化蛋白质体系和寻找MT1 MMP

泛素—核糖体蛋白S27a基因的克隆、测序及其原核GST融合表达和纯化

目的:克隆泛素—核糖体蛋白S27a基因并在大肠杆菌细胞内高效表达,并纯化该蛋白。方法:从HL-60细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得泛素/核糖体蛋白S27a的编码区cDNA,将HindⅢ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样双酶切的GST融合表达载体pGEXGST构建为融合表达质粒pGEXGST-S27a,转化感受态的大肠杆菌JM109实现质粒的扩增与纯化,经DNA测序确证后再转化感受态表达菌BL21,表达并纯化出融合蛋白。结果:(1)PCR扩增获得长约560bp的泛素—核糖体蛋白S27a基因片段。(2)SDS-PAGE证明,泛素—核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白的分子量为43kDa。(3)通过过柱法纯化出泛素—核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白。结论:成功克隆出泛素-核糖体蛋白S27a的基因,并在表达菌BL21中可见GST融合表达,并纯化出该融合蛋白,为进一步研究其功能获得了候选蛋白分子。

人粘膜血管定居因子/GST融合基因表达载体的构建与表达

目的构建 h MAd CAM- 1/ GST融合基因表达载体并进行表达。方法采用 PCR技术扩增 h MAd CAM- 1c DNA5 '端 615 bp的基因片段 ,将其插入 p GEM- T质粒中 ,经全自动序列分析仪测序证实后 ,再亚克隆至表达载体 p GEX- 2 T,转化大肠杆菌 DH 5 a表达。结果 SDS- PAGE检测显示 ,表达出相对分子量 5 2 0 0 0 u的融合蛋白 ,占菌体总蛋白的 3 1%左右。West-ern blot分析表明 ,表达蛋白能与抗 h MAd CAM- 1多抗特异性结合。结论 h MAd CAM- 1/ GST融合基因表达载体的构建和表达 ,为深入研究 MAd CAM- 1提供了材料。

金黄色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal Protein A， SPA）分泌型融合表达系统

金黄色葡萄球菌蛋白Ａ（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌＰｒｏｔｅｉｎＡ，ＳＰＡ）分泌型融合表达系统李节，邱平（南京大学生物化学系医药生物技术国家重点实验室，南京２１０００８）引言十几年前，我们制备蛋白质的方法还主要依靠从天然组织或细胞中提取，而现在人们可...

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST p16融合蛋白。方法 以质粒pM p16为模板 ,扩增出p16基因片段 ,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX 6P 1,将所构建的重组质粒pGEX p16转化大肠杆菌BL2 1并诱导表达 ,采用GST蛋白纯化系统进行纯化 ,所得产物进行SDS PAGE及Westernblot鉴定。结果 大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约 4 2kD蛋白 ,其分子量与GST p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16抗体特异性识别。结论 本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST

低分子量尿激酶与Annexin V的融合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。

构建大肠杆菌表达GST兔防御素NP-1融合蛋白表达载体的研究

利用计算机软件对兔防御素基因进行分析,消除大肠杆菌不表达或低效表达密码子。同时利用相关软件对基因进行分析,消除可能影响融合基因表达的一些因素,构建兔防御素大肠杆菌高效表达载体。通过初步表达分析,融合蛋白表达量为菌体总蛋白的27.7％。

基因工程技术制备以组蛋白为核心的新型基因导入系统

目的 构建以组蛋白为核心的新型靶向性基因导入系统。方法 将各功能肽与核心区成分设计成融合基因 ,在大肠杆菌中加以表达 ,获得的融合蛋白通过静电效应与DNA结合形成靶向性的基因导入系统 ,通过体内外报告基因导入试验检测生物学活性。结果 经体内外基因导入实验证明 ,制备的融合蛋白能将外源报告基因靶向性地导入肿瘤细胞和组织。结论 运用基因工程方法制备的融合蛋白适合大规模生产 ,便于质控 ,为靶向性基因导入系统应用于基因治疗提供了新的思路。

GST－IL－1融合基因表达的研究

为研究基因表达的影响因素，将人白细胞介素－１（ＩＬ－１）ｃＤＮＡ的不同片段分别重组入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ中ＧＳＴ基因３￣’端，形成ＧＳＴ－ＩＬ－１融合基因，经ＩＰＴＧ诱导后，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达情况，结果发现ＧＳＴ与全长８１６ｂｐ完整的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因未见有相应蛋白质的表达，且亦未见ＧＳＴ的表达，而ＧＳＴ与５￣’端缺失１８９ｂｐ的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因则看到有相应蛋白质的表达，表达量占细菌蛋白总量的３０％．表明ＩＬ－１ｃＤＮＡ５￣’端１～１８９ｂｐ的序列影响了整个融合基因的表达，即目的基因中远离翻译起始码ＡＵＧ的下游序列也可显著影响该基因的表达．

细胞凋亡过程中核糖体蛋白质S3a水平变化的研究(二)——制备和纯化抗GST/S3a多克隆抗体

目的:制备和纯化抗GST/S3a多克隆抗体。方法:盐析法粗提抗体,用蛋白A-琼脂糖柱纯化IgG,ELISA法检测多克隆抗体水平。结果:ELISA法测定制备和纯化抗GST/S3a多克隆抗体的活性正常,产生了抗原-抗体反应复合物。结论:制备和纯化的抗体血清可以与GST/S3a融合蛋白相结合,产生抗原-抗体反应复合物,说明具有抗GST/S3a融合蛋白的活性。为下一步实验奠定基础。

生长抑素基因在大肠杆菌pThioHis表达系统中的克隆与表达

目的 在大肠杆菌表达系统中高效表达生长抑素 (SS)基因。方法 以天然SS的氨基酸和基因序列为标准 ,将大肠杆菌使用频率较低的密码子分别更换成了使用频率较高的密码子 ,在SS基因的两端加上了合适的酶切位点 ,头部 :KpnI和NcoI;尾部 :PstI(这一酶切位点可与NsiI的切口互补 )。克隆至pThioHisA质粒的KpnI/PstI酶切位点后 ,再克隆至pThioHisA质粒的KpnI/NsiI酶切位点 ,使SS基因分别位于多克隆位点的尾部和前部。结果 重组质粒经酶切鉴定和基因序列测定证明 ,基因完全正确 ,在大肠杆菌TOP10中均得到较好的表达 ,IPTG诱导后 4h表达量基本达到最高 (37℃ ) ;在A60 0 0 .4～ 1.5之间用IPTG诱导均可获得到较好的表达 ,但以 0 .6左右为最佳诱导时机 ;在LB、TB和 2YT培养基中表达量依次为 :TB >LB >2YT ;表达的SS融合蛋白基本为水溶性的 ,具有良好的SS抗原性和免疫原性。

蜡质芽孢杆菌aiiA基因的克隆及融合表达

设计一对可扩增aiiA基因完整的开放阅读框的简并引物对aiiA1和aiiA2,通过PCR技术对3株蜡质芽孢杆菌(Bc)的aiiA基因进行检测.结果表明,它们均含有aiiA基因.利用pMD18-T克隆载体直接从GP7菌株的PCR产物中克隆了aiiA基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号:AY943831)由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质.该蛋白质推测的分子质量为28 ku,等电点约4.235.核苷酸序列的BLAST分析结果表明,与之同源性较高的基因均为Bc组aiiA基因(87%-99%).在氨基酸序列多重比较的基础上,应用PHYLIP软件构建了A iiA蛋白的系统发育树.此外,利用原核融合表达载体pMXB10初步研究了A iiA、几丁质结合蛋白(CBD)及Inte in融合蛋白诱导表达的情况.

cpcB与CT融合蛋白表达质粒在大肠杆菌中的表达和纯化

将人和鲑鱼嵌合型降钙素基因与藻蓝蛋白的β亚基基因相连,插入融合表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL21.融合蛋白cpcB-CT基因在IPTG诱导下获得高效表达.超声破碎后,经SDS-PAGE分析,在48kD处有新增条,灰度扫描测定,过表达蛋白量占50%～60%,85%为包涵体.包涵体经变性、复性,过Glutathion-Sepharose-4B亲和吸附柱,获含有GST的融合蛋白,该蛋白经凝血酶消化和截留分离,获得纯化的融合蛋白cpcB-CT.Western blotting分析表明,产物具有与合成人降钙素相似的抗原决定簇部分;ELISA-受体法和大鼠降血钙试验表明,其具有降血钙作用.提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景.

弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白基因的序列分析及其在大肠埃希菌中的表达

目的分析弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白7(densegranuleprotein,GRA7)基因的异同及在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白。方法从弓形虫不同分离株(RH株、ZS2株和GT株)的基因组中特异地扩增出GRA7基因,将目的基因定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠埃希菌JM109并测序。利用互联网上的在线工具CLUSTALW进行序列分析。异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)体外诱导pGEX-4T-1/GRA7重组质粒菌的表达,对表达的目的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),分别以抗抗谷胱甘肽巯基转移酶(GST)抗体、人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Westernblotting分析。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,ELISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果弓形虫不同分离株GRA7的基因序列相同;pGEX-4T-1/GRA7重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,Westernblotting分析表明该蛋白为GST融合蛋白,且能被人抗弓形虫阳性血清所识别;ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合,而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论弓形虫不同分离株GRA7基因具有高度保守性;GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达,且该重组蛋白具有一定免疫反应性。

酵母双杂交筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白--泛素-52氨基酸融合蛋白的鉴定

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验.以初步筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的阳性候选克隆,筛选获得8个阳性克隆,其中1个与人泛素-52氨基酸融合蛋白基因(UBA52)的cDNA序列有高度同源性(100%).GST pull-down实验在细胞外进一步证实了CK2α′与UBA52之间存在相互作用.本实验证明,人泛素-52氨基酸(UBA52)融合蛋白是人CK2α′亚基的相互作用蛋白,它们之间的相互作用对精子发生机制的影响尚不清楚,进一步分子机制研究正在进行中.

A组链球菌M蛋白重组多肽原核表达载体构建及融合蛋白的表达

目的:设计针对A组β溶血性链球菌M1和M12蛋白的复合多肽;构建含M蛋白基因(emm基因)1型和12型特异性抗原决定簇基因及其保守区J14肽基因的GST标签的重组表达载体;并诱导和优化GST融合蛋白的表达。方法:在NCBI Genebank和Oligo 6引物设计软件中选择分别编码M蛋白emm基因1型和12型信号肽后35个氨基酸及其相同的保守区14肽基因序列(全长270 bp),通过重叠PCR(Overlap PCR)合成所需的核苷酸序列,经测序确定序列完全和设计的相匹配后,将该重组片段克隆到pGEX-4T-1表达载体中,阳性克隆经双酶切和测序鉴定正确后建立稳定表达该重组质粒的大肠杆菌BL21株系(pE/B);通过聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色和Western blot来检测在不同时间(0、2、6、8、18和24小时)和温度(25℃、30℃和37℃)以及不同浓度(0.01、0.1、1 mmol/L)异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导GST融合蛋白(GST/emm)表达情况,并对诱导表达的GST/emm切胶进行质谱分析鉴定。结果:成功构建含有emm1和emm12抗原决定簇及M蛋白保守区J14肽基因的原核表达载体;并诱导其稳定表达,在1 mol/L IPTG诱导6～8小时达高峰,不同温度下均有过量表达;质谱检测诱导蛋白GST/emm条带结果正确。结论:成功构建A组β溶血性链球菌的emm1型和emm12型原核表达载体,并稳定诱导GST/emm表达,为下一步研究GST/emm的纯化、酶切以及免疫原性的鉴定和疫苗研制打下夯实的基础。

生长抑素(SS)基因在pET-32表达系统中的高效表达

分别将SS基因克隆至pET 32a和pET 32c表达系统中 ,得到重组质粒SS N/X和SS N/S。实验结果表明 ,SS N/X Thioredoxin (硫氧还原蛋白 )和SS N/S Thioredoxin融合蛋白在IPTG (异丙基硫代 β D半乳糖苷 )诱导 3h后(37℃ )表达产量最高 ,约占菌体总蛋白的 30 %左右。 0 0 5～ 1mmol·L-1IPTG对SS融合蛋白表达产量的影响并不太大 ,0 0 5mmol·L-1IPTG即可达到有效的诱导效果 ,但单位体积内的表达产量以 0 5mmol·L-1时为最高。乳糖诱导 4h(37℃ )的效果明显低于IPTG ,但当培养时间延长至 8h时 ,2 0mg·mL-1的乳糖可达到与IPTG同样的诱导效果 ,10和 5mg·mL-1的乳糖也可接近IPTG的诱导效果。SS N/X融合蛋白在 2 6℃表达时 ,主要以可溶性形式存在 ,占75 8% ,包涵体仅占 2 4 2 % ;而SS N/S融合蛋白则主要以包涵体形式存在 ,占 6 0 2 % ,可溶性蛋白仅占 39 8%。SS可溶性融合蛋白具有良好的SS抗原性。

幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22克隆、表达和鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22,构建幽门螺杆菌omp22基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据。方法:利用PCR技术从Helicobacter pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA上扩增omp22基因,并将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果:PCR方法扩增的omp22基因长度约为540 bp。经酶切鉴定,插入到表达载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为22 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%。结论:成功克隆并构建了omp22基因高效原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础。