人粘膜血管定居因子/GST融合基因表达载体的构建与表达

目的构建 h MAd CAM- 1/ GST融合基因表达载体并进行表达。方法采用 PCR技术扩增 h MAd CAM- 1c DNA5 '端 615 bp的基因片段 ,将其插入 p GEM- T质粒中 ,经全自动序列分析仪测序证实后 ,再亚克隆至表达载体 p GEX- 2 T,转化大肠杆菌 DH 5 a表达。结果 SDS- PAGE检测显示 ,表达出相对分子量 5 2 0 0 0 u的融合蛋白 ,占菌体总蛋白的 3 1%左右。West-ern blot分析表明 ,表达蛋白能与抗 h MAd CAM- 1多抗特异性结合。结论 h MAd CAM- 1/ GST融合基因表达载体的构建和表达 ,为深入研究 MAd CAM- 1提供了材料。

GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究

将构建好的可表达GST融合蛋白的重组病毒AcMNPV OCC- GST 6xHis Etp2 8感染Sf9细胞 ,一定时间后取感染了病毒的细胞裂解物上清液进行SDS PAGE分析 ,结果显示 5 3kDa的融合蛋白 (GST 6xHis Etp2 8)呈不溶状态。在原有裂解液的基础上 ,加固体十二烷基肌氨酸钠至终浓度 1.5 % ,并将TritonX 10 0的比例由 1%提高到 2 %。SDS PAGE结果显示至少有 1/ 3的GST 6xHis Etp2 8处于溶解状态 ,可溶性GST 6xHis Etp2 8经亲合层析 ,5

抑瘤素-M(OSM)在GST融合表达系统中的表达、纯化和活性测定

抑瘤素Ｍ是一种具有多种生物活性的细胞因子，具有重要的研究价值和潜在的应用前景。基于ＧＳＴ融合表达载体，构建了一个ＯＳＭ的高效表达系统，诱导表达后融合蛋白占全菌蛋白的５０％以上，在低温诱导的条件下，可溶性蛋白中融合蛋白的含量可达１５％。在对包涵体形式的融合蛋白变复性的基础上，通过亲和层析一步纯化达到９０％左右的纯度。对融合蛋白进行了活性测定，结果提示了Ｎ端的头两个氨基酸对ＯＳＭ的生物活性是重要的。

口蹄疫病毒融合表位基因在pET原核系统的高表达及产物的纯化

构建口蹄疫融合表位基因 - SG表达载体 p ET- SG,转化重组子与 K80 2 ,新鲜过夜菌以 2 %接种量接种 2 YT培养液 ,37℃培养 2 h后用 IPTG诱导 ,每隔 1h取样 ,共 8h。根据 SDS- PAGE结果 ,口蹄疫融合表位基因 - SG在 p ET原核表达系统可获得较高表达 ,用 IPTG诱导 4 h蛋白表达量最高 ,用 Ni+柱亲和层析可得到较纯蛋白。

细胞凋亡过程中核糖体蛋白质S3a水平变化的研究(一)──应用GST基因融合蛋白系统制备核糖体蛋白质S3a(RPS3a)

目的：应用GST基因融合蛋白系统制备核糖体蛋白质S3a(RPS3a)。方法：将S3a cDNA序列插入到pGEX-4T-2质粒中，制备GST/S3a融合蛋白及其抗体。结果：S3a cDNA序列在Xho I位点上插入到pGEX-4T-2质粒中，形成重组的pGEX-4T-2/S3a质粒。结论：pGEX-4T-2质粒编码GST蛋白基因，在IPTG的诱导下可以表达GST/S3a融合蛋白。为下一步实验奠定了基础。

泛素—核糖体蛋白S27a基因的克隆、测序及其原核GST融合表达和纯化

目的:克隆泛素—核糖体蛋白S27a基因并在大肠杆菌细胞内高效表达,并纯化该蛋白。方法:从HL-60细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得泛素/核糖体蛋白S27a的编码区cDNA,将HindⅢ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样双酶切的GST融合表达载体pGEXGST构建为融合表达质粒pGEXGST-S27a,转化感受态的大肠杆菌JM109实现质粒的扩增与纯化,经DNA测序确证后再转化感受态表达菌BL21,表达并纯化出融合蛋白。结果:(1)PCR扩增获得长约560bp的泛素—核糖体蛋白S27a基因片段。(2)SDS-PAGE证明,泛素—核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白的分子量为43kDa。(3)通过过柱法纯化出泛素—核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白。结论:成功克隆出泛素-核糖体蛋白S27a的基因,并在表达菌BL21中可见GST融合表达,并纯化出该融合蛋白,为进一步研究其功能获得了候选蛋白分子。

低分子量尿激酶与Annexin V的融合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。

GST－IL－1融合基因表达的研究

为研究基因表达的影响因素，将人白细胞介素－１（ＩＬ－１）ｃＤＮＡ的不同片段分别重组入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ中ＧＳＴ基因３￣’端，形成ＧＳＴ－ＩＬ－１融合基因，经ＩＰＴＧ诱导后，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达情况，结果发现ＧＳＴ与全长８１６ｂｐ完整的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因未见有相应蛋白质的表达，且亦未见ＧＳＴ的表达，而ＧＳＴ与５￣’端缺失１８９ｂｐ的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因则看到有相应蛋白质的表达，表达量占细菌蛋白总量的３０％．表明ＩＬ－１ｃＤＮＡ５￣’端１～１８９ｂｐ的序列影响了整个融合基因的表达，即目的基因中远离翻译起始码ＡＵＧ的下游序列也可显著影响该基因的表达．

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST p16融合蛋白。方法 以质粒pM p16为模板 ,扩增出p16基因片段 ,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX 6P 1,将所构建的重组质粒pGEX p16转化大肠杆菌BL2 1并诱导表达 ,采用GST蛋白纯化系统进行纯化 ,所得产物进行SDS PAGE及Westernblot鉴定。结果 大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约 4 2kD蛋白 ,其分子量与GST p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16抗体特异性识别。结论 本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST

弓形虫主要表面抗原基因编码序列的扩增、克隆及原核融合表达

目的扩增弓形虫主要表面抗原（P30）基因编码序列并进行重组表达方法设计合成引物，从弓形虫基因组DNA中扩增P30基因编码序列，克隆入载体pGEM-T和PGEX-4T-1，经PCR和酶切筛选，测序验证后，进行诱导表达和Westemblot鉴定结果从弓形虫基因组DNA中扩增出P30基因编码序列，并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组P30结论P30克隆载体和GST融合表达载体的构建和P30的成功表达，为进一步从基因水平和蛋白水平研究P30及进行诊断试剂和疫苗研究创造了条件。

生长抑素基因在大肠杆菌pThioHis表达系统中的克隆与表达

目的 在大肠杆菌表达系统中高效表达生长抑素 (SS)基因。方法 以天然SS的氨基酸和基因序列为标准 ,将大肠杆菌使用频率较低的密码子分别更换成了使用频率较高的密码子 ,在SS基因的两端加上了合适的酶切位点 ,头部 :KpnI和NcoI;尾部 :PstI(这一酶切位点可与NsiI的切口互补 )。克隆至pThioHisA质粒的KpnI/PstI酶切位点后 ,再克隆至pThioHisA质粒的KpnI/NsiI酶切位点 ,使SS基因分别位于多克隆位点的尾部和前部。结果 重组质粒经酶切鉴定和基因序列测定证明 ,基因完全正确 ,在大肠杆菌TOP10中均得到较好的表达 ,IPTG诱导后 4h表达量基本达到最高 (37℃ ) ;在A60 0 0 .4～ 1.5之间用IPTG诱导均可获得到较好的表达 ,但以 0 .6左右为最佳诱导时机 ;在LB、TB和 2YT培养基中表达量依次为 :TB >LB >2YT ;表达的SS融合蛋白基本为水溶性的 ,具有良好的SS抗原性和免疫原性。

生长抑素(SS)基因在pET-32表达系统中的高效表达

分别将SS基因克隆至pET 32a和pET 32c表达系统中 ,得到重组质粒SS N/X和SS N/S。实验结果表明 ,SS N/X Thioredoxin (硫氧还原蛋白 )和SS N/S Thioredoxin融合蛋白在IPTG (异丙基硫代 β D半乳糖苷 )诱导 3h后(37℃ )表达产量最高 ,约占菌体总蛋白的 30 %左右。 0 0 5～ 1mmol·L-1IPTG对SS融合蛋白表达产量的影响并不太大 ,0 0 5mmol·L-1IPTG即可达到有效的诱导效果 ,但单位体积内的表达产量以 0 5mmol·L-1时为最高。乳糖诱导 4h(37℃ )的效果明显低于IPTG ,但当培养时间延长至 8h时 ,2 0mg·mL-1的乳糖可达到与IPTG同样的诱导效果 ,10和 5mg·mL-1的乳糖也可接近IPTG的诱导效果。SS N/X融合蛋白在 2 6℃表达时 ,主要以可溶性形式存在 ,占75 8% ,包涵体仅占 2 4 2 % ;而SS N/S融合蛋白则主要以包涵体形式存在 ,占 6 0 2 % ,可溶性蛋白仅占 39 8%。SS可溶性融合蛋白具有良好的SS抗原性。

金黄色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal Protein A， SPA）分泌型融合表达系统

金黄色葡萄球菌蛋白Ａ（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌＰｒｏｔｅｉｎＡ，ＳＰＡ）分泌型融合表达系统李节，邱平（南京大学生物化学系医药生物技术国家重点实验室，南京２１０００８）引言十几年前，我们制备蛋白质的方法还主要依靠从天然组织或细胞中提取，而现在人们可...

构建大肠杆菌表达GST兔防御素NP-1融合蛋白表达载体的研究

利用计算机软件对兔防御素基因进行分析,消除大肠杆菌不表达或低效表达密码子。同时利用相关软件对基因进行分析,消除可能影响融合基因表达的一些因素,构建兔防御素大肠杆菌高效表达载体。通过初步表达分析,融合蛋白表达量为菌体总蛋白的27.7％。

家蚕核型多角体病毒gp41基因的融合表达及功能鉴定

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。

生长抑素(SS)基因在大肠杆菌pT7ZZ表达系统中的克隆与表达

目的 构建和筛选既能稳定、高效表达SS融合蛋白，又能使这种融合蛋白保持良好的SS抗原性和高水溶性等特点的重组质粒。方法 用 BamH I/Xho I (B/X）和 BamH I/EcoR I（B/E）双酶切，将含有SS基因的片段由pThioHis A中切出，然后分别克隆到 pT7ZZa中的相应酶切位点，得到pSSB/X（短尾）和pSS-B/E(长尾)两个重组质粒，用常规表达技术在大肠杆菌中对其进行表达。结果 pSS-B/X和pSS-B/E两个重组质粒在宿主菌BL21（DE3）中均获得表达，pSS-B/X获得高效表达后融合蛋白占菌体总蛋白的30．6％。两个表达菌经超声裂解后电泳发现，SS－B/X－ZZ和SS－B/E－ZZ这两种融合蛋白基本为可溶性蛋白，沉淀中含量极低。二者均具有良好的抗原性，结论pSS-B/X重组质粒很有希望成为SS基因疫苗的候选质粒。

高致病性猪蓝耳病病毒GST-N融合蛋白的原核表达及纯化

为了构建高致病性猪蓝耳病病毒(HPPRRSV)GST-N融合蛋白,试验采用RT-PCR技术扩增ORF7基因片段,对其胶回收产物进行测序分析,再将目的片段连接到质粒PGEX-6P-1上,得到重组质粒PGEX-6P-1-N,并转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,筛选阳性菌落,并用IPTG进行诱导表达,应用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行检测与鉴定。结果表明:该序列与GenBank公布的HN2007的同源性为97%;重组质粒在大肠杆菌中获得了表达,表达产物为42ku的GST-N融合蛋白。

人ICA69基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达与应用初探

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达国人胰岛细胞自身抗原69kd蛋白（hICA69)，获得足量的、可供实验研究的ICA69抗原，用于I型糖尿病的早期诊断和联合筛查。方法：用PCR法扩增出编码hICA69的cDNA片段，直接克降到pSPORT1质粒上，经DNA序列测定后，再插入到GST融合蛋白表达载体pGEX-2T的EcoRI和SmaI位点之间，构成重组质粒p25-hICA69,将此质粒导入大肠杆菌，经IPIG诱导后获得GST-hICA69融合蛋白的表达产物，用间接ELISA法检测100例正常人和30例I型糖尿病人血清中抗ICA69抗体。结果：所获PCR产物经序列分析确证为1449bp，编码483个氨基酸，并正确地重组到pGEX-2T表达型质粒中，其在原核细胞中表达的融合蛋白具有免疫原性，并能应用于I型糖尿病病人血清中抗ICA69抗体的检测。结论：运用基因工程技术获得的表达产物的重组ICA69抗原。这一抗原的获得，将有助于提高I型糖尿病的预报率和确诊率。

小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达

【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达,以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据Gene Bank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板,经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化TGⅠ大肠杆菌,筛选阳性克隆,其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达,主要以包涵体形式存在;融合蛋白的分子量为63 kD;以IPTG终浓度为0.8 mmol.L-1,诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。