GSK3β及其显性负突变体的原核表达与纯化

目的:构建原核表达GST-GSK3β1、GST-GSK3β2及其显性负突变体(dominant-negative mutant)GST-GSK3β1 K85M的重组质粒,并进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定。方法:利用PCR扩增和基因重组技术,以含有人源目的片段的质粒Flag-GSK3β1、YFP-GSK3β2及Flag-GSK3β1 K85M为模板,扩增出相应的目的基因片段,并将其插入具有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST融合蛋白表达质粒。通过对GST-GSK3β1、GST-GSK3β2和GST-GSK3β1 K85M融合蛋白进行诱导表达、温和法裂解以及纯化实验,确立有效的表达和纯化方法。最后应用Western blot方法鉴定纯化的融合蛋白。结果:成功构建GST-GSK3β及其显性负突变体质粒,并通过诱导表达和纯化得到目的蛋白。结论:GST-GSK3β1、GST-GSK3β2及GST-GSK3β1K85M显性负突变体质粒的成功构建及目的蛋白的表达与纯化,为更深入地研究GSK3β蛋白的生物学功能奠定基础。