小G蛋白RhoA活性检测方法的优化

Rho蛋白家族的小G蛋白是调节细胞迁移的关键蛋白,具有GTP酶活性。RhoA是该蛋白家族的重要成员,通过其催化活性来调节肌动蛋白的聚集和收缩,在肿瘤迁移和侵袭中发挥重要作用。所以,RhoA的GTP酶活性检测对于研究细胞迁移的机制,以及靶向RhoA的治疗策略具有重要意义。RhoA下游效应子Rhotekin基因(RhoA effector)具有RhoA结合结构域(RhoA binding domain,RBD),该RBD蛋白结构域能与活化状态的GTP-RhoA特异结合。通常用外源表达的RBD蛋白pulldown结合GTP-RhoA的蛋白量,作为RhoA活性检测方法。但是,哺乳动物来源的RBD蛋白在原核细胞中的表达量很低,使得pulldown结合GTP-RhoA蛋白量的效率低下,从而不利于RhoA的活性检测。因此,目的在于提高RBD蛋白在大肠杆菌中的产量,提高RBD蛋白pulldown结合GTP-RhoA的效率,从而优化RhoA活性检测方法。通过密码子优化技术对RBD基因进行改良,提高其蛋白在大肠杆菌中的表达量,优化RBD蛋白pulldown实验检测GTP-RhoA的效率。优化后的RBD与GST标签蛋白融合后在大肠杆菌中高效表达,并且能够特异性地与GTP-RhoA结合。成功地构建了具有较高表达水平的GST-RBD载体,并优化了传统的GST-RBD pulldown检测体系,为进一步深入研究RhoA在细胞迁移中的功能提供了一种有效的技术手段。