果胶裂解酶PelC基因在原核和真核细胞中的表达

对原核E.coliBL21(DE3)-pET28a-PelC和真核GS115-pPIC9K-PelC工程菌的表达效果进行初步研究。结果表明:原核E.coliBL21(DE3)-pET28a-PelC工程菌表达果胶裂解酶,分子量约44ku;诱导表达19h后,果胶裂解酶活性在温度50℃、pH值5.4时,达到峰值,胞内表达酶活为24.01U/mL。真核GS115-pPIC9K-PelC工程菌分泌表达果胶裂解酶,分子量为43ku;诱导表达60h后,果胶裂解酶活性在温度50℃、最适pH值5.4时达到峰值,活力最高为14.2U/mL。两种表达系统的酶活比较,为以酶法脱胶方式改进传统酸碱脱胶工艺,推动绿色菠萝叶麻纺织产业打下基础。

高山被孢霉Δ5去饱和酶基因的克隆及异源表达研究

通过RT-RCR的方法从高山被孢霉W15菌株中扩增到完整的Δ5去饱和酶基因,其全长为1341bp,编码446个氨基酸。对推导的氨基酸序列进行分析表明,其N末端存在细胞色素b5结构域,在序列中还存在3个保守的组氨酸富集区。将该基因连接到表达载体pPIC3.5K上,转化毕赤酵母细胞,利用G418筛选高拷贝数的转化子。以双高γ-亚麻酸为底物,在甲醇诱导的条件下,Δ5去饱和酶可催化底物脱氢生成花生四烯酸,其含量占总脂肪酸含量的2.85%。说明克隆的Δ5去饱和酶基因能在毕赤酵母中进行功能性的表达。

Bohaisea-9145海洋耶氏酵母碱性脂肪酶基因的克隆、异源表达和重组酶酶学性质

采用基因重组和分子生物学相关技术,对Yarrowia lipolytica Bohaisea-9145海洋低温碱性脂肪酶(Y.lipolytica Bohaisea-9145,LipYp)基因lipYp(1116bp)克隆并在Pichia pastoris中进行了异源真核表达研究。通过MD和MM平板及PCR扩增,筛选和鉴定了重组子。结果表明,阳性重组子经摇瓶发酵54h后上清液酶活力达到1956U/ml。发酵液经两步纯化得到在SDS-PAGE上显示为单一条带的重组脂肪酶。实验同时研究了不同反应温度、pH值对重组LipYp活力和稳定性的影响,结果显示重组LipYp最适反应温度和pH分别为35℃和8.5,在pH7.0-10.5之间以及45℃以下有较好稳定性。另外,重组脂肪酶对中长链对硝基苯基酯类和甘油三酯类(C10-C12)有较强的水解能力。

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据GenBank中aiiA基因设计引物,以苏云金芽孢杆菌基因组为模板扩增出aiiA基因后构建出pPIC9K-aiiA重组表达载体,线性化后转化毕赤酵母GS115,获得重组工程菌GS115/pPIC9K-aiiA,以体积分数为1%的甲醇进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE及Western blotting分析显示表达的蛋白具有较好的免疫特异性.抗病性实验显示表达的目的蛋白具有生物学活性和良好的抗病能力.