高温对玉米种苗转化过程中关键水解酶活性及ATP含量的影响研究

高温主要通过影响各种水解酶的活性对玉米种苗转化的生理特性产生影响。高温下水解蛋白质、淀粉和脂肪的各种水解酶活性加强,在整个种苗转化过程中始终能保持较高的能量水平,代谢活动旺盛、贮藏物质降解迅速、新生组织快速获得养分,有利于幼苗的早生快发。

酪氨酸羟化酶和GTP环水解酶-1基因修饰永生化成纤维细胞及其表达研究

目的 探讨酪氨酸羟化酶 (TH)和GTP环水解酶 1(GCH)基因修饰的永生化成纤维细胞的可行性和表达能力 ,为其混合移植治疗帕金森病 (PD)作准备。方法 SV40大T抗原转化成纤维细胞使其永生化。构建TH和GCH基因真核表达质粒并转染永生化成纤维细胞 ,利用免疫组化和RT PCR检测其在体内外的表达。结果 TH和GCH基因修饰的永生化成纤维细胞在体外可长期传代培养且可有效表达 ,脑内移植后TH基因至少可表达 8周以上。

GTP环化水解酶Ⅰ/四氢生物蝶呤通路对高血压内皮祖细胞体外活性和体内再内皮化能力的调节

目的研究GTP环化水解酶Ⅰ/四氢生物蝶呤信号通路对高血压患者循环内皮祖细胞功能的调节。方法分别纳入高血压患者和健康志愿者各19例,采集外周血进行内皮祖细胞分离、培养及鉴定,评估其迁移、增殖、黏附活性;建立裸鼠动脉损伤模型并移植高血压患者和健康志愿者内皮祖细胞,评估内皮祖细胞修复损伤血管内皮功能,并检测内皮祖细胞GTP环化水解酶Ⅰ/四氢生物蝶呤通路及一氧化氮、环磷酸鸟苷、凝血酶敏感蛋白1的mRNA表达水平。通过基因干扰、基因转染或药物阻滞干预,进一步证实该信号通路对内皮祖细胞功能的调节作用。结果高血压患者内皮祖细胞体外活性及体内再内皮化功能降低,且内皮祖细胞GTP环化水解酶Ⅰ/四氢生物蝶呤通路及其下游信号分子一氧化氮、环磷酸鸟苷的mRNA表达水平亦下降,而凝血酶敏感蛋白1 mRNA表达水平则升高。抑制该信号通路的表达可削弱内皮祖细胞的体外活性及再内皮化功能。结论研究证实GTP环化水解酶I/四氢生物蝶呤通路可通过凝血酶敏感蛋白1及可溶性鸟苷酸环化酶/环磷酸鸟苷系统调节高血压患者内皮祖细胞的体外及体内功能。

汉族多巴反应性肌张力障碍患者中的GTP环化水解酶I基因缺失

目的:基于对汉族人群中的多巴反应性肌张力障碍(DRD)患者基因突变的研究,进一步探究GTP环化水解酶I基因(GCH1)、酪氨酸羟化酶基因(TH)、Epsilon-sarcoglycan编码基因(SGCE)上是否存在外显子缺失。方法:对来自4个DRD家系共8名患者及其5名无症状家属、10名散发性DRD患者和3名正常对照者的GCH1、TH、SGCE基因的22个外显子进行多重连接式探针扩增(MLPA)分析,对MLPA结果出现异常的外显子采用实时定量PCR(qPCR)进行验证,然后使用ddCt法与正常对照者比较分析GCH1、TH、SGCE基因是否存在外显子缺失。结果:1名散发性DRD患者的GCH1基因1号外显子出现杂合缺失,正常对照均未发现此外显子缺失。其余家系或散发性患者未检测到外显子缺失或扩增。结论:在汉族人群中,散发性DRD患者GCH1基因存在外显子缺失,但出现频率较低;对于突变阴性的散发性DRD患者,有必要检测其GCH1基因是否存在缺失。

ATP/GTP结合蛋白1基因在胃癌及食管癌组织中高表达

目的:应用荧光mRNA差异显示技术(DD-PCR),筛选胃癌及食管癌相关基因的异常表达。方法:收集临床胃癌组织样本,通过荧光差异显示技术(DD-PCR)获得胃癌样品中差异的片段,对这些片段进行克隆和测序。通过在GenBank中同源性检索,查找与差异片段相对应的同源基因。利用半定量PCR及定量PCR方法检验该基因在胃癌及食管癌组织中与其对应正常组织之间表达的差异。结果:通过DD-PCR获得的一个差异表达片段的序列对应于ATP/GTP结合蛋白1基因(A/GT-PBP1)。半定量PCR及荧光定量PCR技术检测结果表明,A/GTPBP1基因在胃癌及食管癌组织中的表达量高于其对应的正常组织(胃癌,P<0.01;食管癌,P<0.01)。该基因包含25个外显子,读码框长3561bp,编码1186个氨基酸,蛋白质相似性分析表明该蛋白为G蛋白家族成员。结论:A/GTPBP1在胃癌组织中异常表达,可能在胃癌发生过程中起调节作用。

胃癌中高表达ATP/GTP结合蛋白1基因的筛选及验证

目的:探讨胃癌中差异表达的基因在胃癌发生和发展的分子机制中的作用.方法:提取胃癌组织样本的总RNA,通过荧光差异显示技术(DD-PCR)获得胃癌样品中差异的片段,对这些片段进行克隆和测序.通过在GenBank中同源性检索,查找与差异片段相对应的同源基因.利用半定量PCR及定量PCR方法验证该基因表达的差异性.结果:通过DD-PCR得到差异片段中的一个片段对应与人ATP/GTP结合蛋白1基因(A/GTPBP1).半定量PCR及荧光定量PCR技术检测结果表明,A/GTPBP1基因在胃癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织.该基因的读码框长3561bp,编码1186个氨基酸,分子质量为84.4kDa,蛋白质相似性分析表明该蛋白为G蛋白家族成员.结论:A/GTPBP1在胃癌组织中异常高表达,可能在胃癌发生过程中起调节作用。

白念珠菌人工诱导耐药株唑靶酶三磷酸鸟苷环水解酶Ⅰ功能区的序列分析

目的:研究羊毛甾醇14α脱甲基酶(14DM)DNA序列中三磷酸鸟苷(GTP)环水解酶Ⅰ功能区域基因突变与白念珠菌对氟康唑耐药性的关系。方法:体外采用氟康唑结合阿苯达唑进行人工耐药性诱导1株白念珠菌标准菌株和2株临床分离对氟康唑敏感株,将获得的3株人工诱导耐药白念菌株和另外2株临床分离对氟康唑耐药的白念菌株,通过PCR扩增目的片段,并克隆到pMD18T载体上,测序分析诱导前后基因序列碱基变化。结果:经体外人工耐药性诱导后,标准白念珠菌菌株和临床分离敏感白念珠菌菌株GTP环水解酶Ⅰ功能区域多处碱基突变,部分碱基变化引起了氨基酸的改变,与临床分离耐药白念珠菌在碱基变化及其导致的编码氨基酸变化相似。结论:14DMGTP环水解酶Ⅰ功能区域基因突变与白念珠菌的耐药性有相关性。

人胆固醇酯水解酶对泡沫细胞的影响及相关机制的研究

目的探讨人胆固醇酯水解酶（hCEH）表达对泡沫细胞的影响及相关机制。方法利用含hCEH的慢病毒转染RAW264．7小鼠单核巨噬细胞，转染成功后巨噬细胞泡沫化。油红O染色和高效液相色谱分析hCEH对细胞内脂滴堆积情况及游离胆固醇含量变化的影响；Western blot检测ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）、ATP结合盒转运蛋白G1（ABCG1）的表达情况。结果转染72h后，荧光细胞数量最多，接近50％，hCEH在细胞内大量表达；随着时间的延长，油红O染色阳性细胞数逐渐减少，细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量逐渐下降；Western blot显示在0～8h，ABCA1和ABCG1表达逐渐增加，8h达高峰，以后逐渐减少。结论hCEH表达可以促进巨噬细胞表面ABCA1、ABCG1的表达，并且ABCA1、ABCG1之间存在一定的协同性，从而有效增加了游离胆固醇外流、减少胆固醇酯在细胞内聚积，抑制泡沫细胞形成。

流产布鲁氏菌ATP／GTP结合蛋白基因缺失株保护力及安全性研究

为筛选具有诊断标记的布鲁氏菌病疫苗菌株，本研究利用同源重组和负筛选技术，构建了流产布鲁氏菌株2308的ATP／GTP结合蛋白基因缺失株BDA14，并通过菌落染色和凝集特性，培养传代，小鼠接种试验及怀孕羊攻毒试验对其生物学特性、安全性和免疫效果进行了研究。

高比活度[α-^(32)P]ATP的酶法标记

以［γ－３２Ｐ］ＧＴＰ作磷酸供体通过四步酶反应制备了高比活度（＞１４８ＰＢｑ／ｍｏｌ）的［α－３２Ｐ］ＡＴＰ。用高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）测定了［α－３２Ｐ］ＡＴＰ比活度，并对影响［α－３２Ｐ］ＡＴＰ比活度的诸因素作了分析。

Rho GTP酶与智力落后

智力落后性疾病的一个共同特点是患者神经元突起数目改变和形态异常 ,提示神经回路的建立和成熟与智力发育密切相关。神经元内RhoGTP酶是决定轴突、树突生长及相互构成联系的重要信号蛋白 ,对神经发育和重塑起重要作用。RhoGTP酶信号通路异常影响神经网络形成 ,可能是智力落后的机制之一。

金属离子对GTP结合蛋白Cdc42Hs的内源性GTP酶活性的影响

不同的金属离子会对GTP结合蛋白Cdc42Hs的内源性GTP水解酶活性产生不同的影响。相对于生理条件下的辅基Mg2 + 而言 ,Mn2 + 对Cdc42Hs酶活力有所激活 ,表现在饱和浓度时 ,实验曲线指数项的表观速率常数kobs 有2倍左右的提高 ,而其稳态反应速度要低于Mg2 +。Mg2 +和Mn2 +的实验曲线在本质上没有什么差别 ,都是一个指数项和一个一次项的叠加 ,说明Mn2 + 和Mg2 + 以相似的机制结合于Cdc42Hs。在Ca2 + 存在时 ,实验曲线无明显的指数项出现 ,Ca2 + 的存在仅使稳态反应速度有所降低 ,说明Ca2 + 以不同于Mg2 + 和Mn2 + 的机理与Cdc42Hs结合。随着Mg2 +和Mn2 +离子浓度的增大 ,指数项的表观速率常数kobs 逐步升高 ,稳态反应速度υs 逐渐降低。进一步的动力学模型分析得到了这一反应的微观动力学常数和Mg2 +、Mn2 +与蛋白的结合常数。

广西蛇毒中的ADP酶、ATP酶和5′核苷酸酶

蛇毒含多种不同的磷酸酯水解酶类。其中5′核苷酸酶、非特异性磷酸单酯酶和磷酸二酯酶研究较多、较清楚。但ATP酶和ADP酶是否独立存在意见不一。Schenberg研究了白头蝰(Bitis ariatans)加蓬咝蝰(Bitis gabonica)美洲矛头腹(Bothrops jararaca)和南美响尾蛇恐怖亚种(Crotalus durissus terrificus)蛇毒的5′核苷酸酶、ADP酶及磷酸二酯酶,认为独立存在ATP酶。Brisbois等报告眼镜蛇(Naja naja atra)毒存在ATP酶。Pereira和Lima也指出ATP酶与磷酸二酯酶是两种不同的酶。然而,Pflevalerer和Ortanderl发现这两种酶的比值在分离纯化中不变,认为两种活力是同一种酶的多种功能。为了证实广西眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)、眼镜蛇(Naja najaatra)和五步蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒是否独立存在ADP酶和ATP酶.

某些中药的Na^+、K^+—ATP酶抑制作用

近几十年来对中药与Na^+、K^+—ATP酶之间的关系作了大量的研究,特别在抗衰老、抗高血压及治疗阴虚内热和心力衰竭方面的中药研究较有特色,下面就有关清热及抗心衰方面做一简单的综述。 1 知母陈锐群等对知母清热泻火的机理作了大量的研究工作。

多酶一锅法合成硫酸基供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)

以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)等为原料,来源于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的ATP硫酸化酶(ATPS)和来源于产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的APS激酶(APSK)构建的多酶催化体系可合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)。同时,在酶法合成PAPS的反应体系中引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的无机焦磷酸水解酶(PPase),消耗反应过程中的副产物PPi,使得反应向生成PAPS的方向进行,大幅提高多酶法合成PAPS的产率。本研究构建了重组质粒pET-28a-sumo-ATPS、pET-28a-APSK和pET-28a-PPase,并在大肠杆菌中表达了重组酶,研究酶学性质和优化多酶催化反应合成PAPS的反应条件,以提高PAPS的产量水平,最终PAPS的累积量为14.47 g/L。该工艺可大幅降低PAPS的制备成本。

非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的细胞核转运及其选择性杀伤肿瘤细胞机制的研究

非晶状体βγ晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物(βγ-CAT)是从大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离的分子量为72kDa的天然蛋白复合物。本研究通过激光共聚焦显微镜和Western blot分析βγ-CAT在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的细胞核转运机制,以及βγ-CAT对多株肿瘤细胞(HCT116,HT29,A375,Hela,THP-1等)的细胞毒效应。结果表明:βγ-CAT的α亚基中含有典型的GTP/ATPase的保守结构模体Walker A和Walker B,体外检测到βγ-CAT具有GTP/ATP水解酶和GTP/ATP结合活性。在细胞核转运过程中,βγ-CAT的α亚基和β亚基参与形成约150kDa含有泛素化修饰信号的大分子复合物,且泛素化修饰信号和βγ-CAT的α亚基和β亚基共定位于细胞内和融合于细胞核区域的转运囊泡小体中。βγ-CAT能够选择性的杀伤肿瘤细胞,诱导肿瘤细胞脱落和发生凋亡。上述结果为进一步深入研究βγ-CAT的细胞核转运和调节细胞功能的分子作用机制提供思路和线索。

基于农产品安全下肠道细菌病原体的铁离子转运与调控

了解和掌握食物与人体的生物反应、元素转换,以及了解生命体的健康原理是非常必要的。铁离子是许多生物重要生命活动必不可少的元素,研究表明铁离子在肠道病原体已经进化出了几种不同的策略摄取铁离子,其中ATP或GTP依赖的Fe2+内膜转运蛋白和TonB-ExbB-ExbD依赖的Fe3+(转铁蛋白、血红素与血红素绑定蛋白)的铁离子转运系统最为重要;Fur(Fe-regulated uptake repressor)家族主要负责肠杆菌铁转运系统的调控。

蛋白质的种类及其作用

蛋白质是生物大分子,承担着主要生命活动,蛋白质相关的内容涉及到细胞的结构,跨膜运输,能量代谢,细胞的分裂,基因的表达,膜电位的变化,动植物生命活动的调节及发酵技术;其实大都是蛋白质是结合蛋白,它们的结构和组成决定蛋白质的特异性。即蛋白质发挥作用的过程中既它的构象(立体结构)发生变化,恢复构象。

流产布鲁氏菌ATP/GTP结合蛋白基因缺失株保护力及安全性研究

为筛选具有诊断标记的布鲁氏菌病疫苗菌株,本研究利用同源重组和负筛选技术,构建了流产布鲁氏菌株2 308的ATP/GTP结合蛋白基因缺失株BDA14,并通过菌落染色和凝集特性,培养传代,小鼠接种试验及怀孕羊攻毒试验对其生物学特性、安全性和免疫效果进行了研究。结果表明:1)缺失菌株BDA14为粗糙型菌株,体外培养传代表型不发生改变;2)缺失菌株BDA14在小鼠体内的毒力与亲本菌株2308相比显著降低,且不产生针对OPS(O-antigen)的抗体;3)缺失菌株BDA14可提供与疫苗株RB51相当的攻毒保护力;4)缺失菌株BDA14对怀孕靶动物的安全性显著提高,接种怀孕羊不引起流产。说明ATP/GTP结合蛋白基因缺失株BDA14作为安全、有效且能鉴别诊断的疫苗菌株有明显优势。

氮硫供应对大葱含硫有机物及其代谢关键酶活性的影响

以长白型大葱品种章丘大葱和鸡腿型大葱品种隆尧鸡腿葱为试材,采用基质盆栽试验研究了不同氮、硫供应水平对大葱含硫有机物含量及其代谢关键酶活性的影响。结果表明,隆尧鸡腿葱含硫有机物含量显著高于章丘大葱。氮、硫供应显著影响植株地上部氮、硫含量与代谢关键酶活性。氮素供应水平为1.5mmol/L时抑制大葱地上部ATP硫酸化酶(ATPS)和O-乙酰丝氨酸水解酶(OASS)活性,而氮素供应水平为12.0 mmol/L时明显促进上述两种酶的活性,但氮素供应水平上升到24.0 mmol/L时则抑制了其活性。提高供硫水平则显著抑制ATPS酶和OASS酶的活性。植株含氮量与有机硫含量均与ATPS和OASS活性显著相关。