陆地棉小GTP结合蛋白基因GhRop4的克隆及其表达分析

【目的】对陆地棉小GTP结合蛋白基因(Small GTP-binding protein)GhRop4(AY965614.1)在多种逆境胁迫下的应答表达模式进行研究分析,为棉花抗逆相关基因克隆及棉花抗逆分子机制研究奠定基础。【方法】利用生物信息学方法分析了GhRop4基因的结构特征和进化树关系,并通过荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)的方法分析Gh Rop4基因的组织表达特异性和不同逆境诱导条件下的表达模式。【结果】以陆地棉c DNA为模板克隆得到GhRop4基因,其开放阅读框为588 bp,编码包含195个氨基酸残基的Ⅰ型Rop蛋白。氨基酸多重序列比对表明,GhRop4与其它植物Rop蛋白高度同源,符合Rop蛋白结构特点。qRT-PCR分析表明,GhRop4基因在棉花幼苗根、茎、叶、子叶和下胚轴中均有表达,且在子叶和茎中表达水平较高。GhRop4基因对高盐、干旱、低温和棉花黄萎病菌处理都有一定程度的响应。【结论】Gh Rop4基因在陆地棉的逆境胁迫适应过程中可能具有重要的作用。

调节小分子GTP结合蛋白Rab27表达对人膀胱癌细胞Cyclin、p-FAK、p-IκB表达的影响

目的观察调节小分子GTP结合蛋白Rab27表达对人膀胱癌细胞中细胞周期蛋白(Cyclin)、磷酸化黏着斑激酶抗体(p-FAK)、核因子κB抑制蛋白(p-IκB)表达的影响。方法取对数生长期人膀胱癌细胞系BIU-87(Rab27低表达细胞系)用Rab27质粒转染,人膀胱癌细胞系5637(Rab27高表达细胞系)用Rab27干扰质粒转染。采用Western blotting法检测转染前后BIU-87及5637细胞Rab27、Cyclin D1、Cyclin E、p-FAK(Tyr925)、p-FAK(Tyr576/577)及p-IκB。结果与Rab27质粒转染前比较,转染后BIU-87细胞Rab27的相对表达量升高,细胞Cyclin D1、Cyclin E、p-FAK(Tyr925)、p-FAK(Tyr576/577)及p-IκB相对表达量均升高(P均<0.05)。与Rab27干扰质粒转染前比较,5637细胞Rab27的相对表达量降低(P均<0.05),细胞Cyclin D1、Cyclin E、p-FAK(Tyr925)、p-FAK(Tyr576/577)及p-IκB相对表达量均降低(P均<0.05)。结论转染Rab27质粒的BIU-87细胞Cyclin D1、Cyclin E、p-FAK(Tyr925)、p-FAK(Tyr576/577)及p-IκB的表达升高。转染Rab27干扰质粒的5637细胞Cyclin D1、Cyclin E、p-FAK(Tyr925)、p-FAK(Tyr576/577)及p-IκB的表达降低。Rab27可能通过调节NF-κB、FAK信号通路的相关蛋白表达来影响膀胱癌细胞周期。

拟南芥Ran小GTP结合蛋白在细胞有丝分裂中的定位

分别采用RT-PCR和直接荧光免疫方法分析Ran2 mRNA在拟南芥不同组织器官中的表达及Ran2的亚细胞定位。结果表明,Ran2基因在拟南芥根、茎、叶和花中均有表达;Ran2蛋白在细胞分裂间期主要定位于核膜周边,在后期定位于赤道板上和纺锤体上,末期又回到子细胞核膜周边。

拟南芥Ran2小GTP结合蛋白抗血清的制备及其FITC荧光标记

将原核表达、纯化的Ran2蛋白对新西兰兔进行免疫制备抗血清,ELISA测定其效价为1∶51 200。免疫印迹分析表明,原核表达、纯化的Ran2和拟南芥可溶性蛋白杂交带均在26 ku处。FITC荧光标记抗体检测Ran2绿色杂交带主要出现在细胞分裂间期的核膜上。

ATP/GTP结合蛋白1基因在胃癌及食管癌组织中高表达

目的:应用荧光mRNA差异显示技术(DD-PCR),筛选胃癌及食管癌相关基因的异常表达。方法:收集临床胃癌组织样本,通过荧光差异显示技术(DD-PCR)获得胃癌样品中差异的片段,对这些片段进行克隆和测序。通过在GenBank中同源性检索,查找与差异片段相对应的同源基因。利用半定量PCR及定量PCR方法检验该基因在胃癌及食管癌组织中与其对应正常组织之间表达的差异。结果:通过DD-PCR获得的一个差异表达片段的序列对应于ATP/GTP结合蛋白1基因(A/GT-PBP1)。半定量PCR及荧光定量PCR技术检测结果表明,A/GTPBP1基因在胃癌及食管癌组织中的表达量高于其对应的正常组织(胃癌,P<0.01;食管癌,P<0.01)。该基因包含25个外显子,读码框长3561bp,编码1186个氨基酸,蛋白质相似性分析表明该蛋白为G蛋白家族成员。结论:A/GTPBP1在胃癌组织中异常表达,可能在胃癌发生过程中起调节作用。

植物GTP结合蛋白的研究进展

GTP结合蛋白(G蛋白)广泛存在于生物界,在细胞信息传导中起着极为重要的开关作用,它可以调控真核生物中高度保守的跨膜信号传导通路。G蛋白可以划分为异源三聚体G蛋白和低分子量G蛋白(Ran)两种类型。Ran是一种大量分布于细胞核内的小分子的GTP酶,在核质运输以及微管蛋白成核过程中具有十分重要的作用。本文主要对G蛋白以及低分子量G蛋白Ran的研究进展做一综述。

大鼠面神经核小GTP结合蛋白TC10的表达和真核表达载体的构建

目的 分析大鼠小GTP结合蛋白TC10基因在大鼠面神经损伤早期的表达和作用 ,构建大鼠TC10的真核表达载体。 方法 由大鼠损伤的面神经核中提取组织总RNA ,利用逆转录聚合酶链反应技术观察面神经损伤后面神经核团TC10的表达变化 ,将获得的基因片段酶切后插入pcDNA3真核表达载体中 ,利用酶切电泳和核苷酸序列分析鉴定。 结果 逆转录聚合酶链反应显示在正常情况下 ,面神经核团有TC10的表达 ,切断后 6h即出现增加 ,2 4h达到最大值。TC10真核表达质粒酶切电泳及序列测定证明 ,所获得的基因片段为大鼠TC10全长基因cDNA序列。 结论 面神经切断后 ,TC10在面神经核团出现急剧增加 ,可能参与了神经元早期损伤反应的信号转录。本实验首次从大鼠面神经核团中获得大鼠TC10的cDNA ,并构建了TC10真核表达质粒。为研究TC10的表达及作用提供了必要条件。

GTP结合蛋白研究的进展

GTP结台蛋白广泛存在于原核和真核生物中,参与细胞内一系列的信息传递过程,如:跨膜信使物质的信号传递,光信号的传递,蛋白质的生物合成,细胞骨架组织的形成等等,其共同特点是结合并利用GTP。

胃癌中高表达ATP/GTP结合蛋白1基因的筛选及验证

目的:探讨胃癌中差异表达的基因在胃癌发生和发展的分子机制中的作用.方法:提取胃癌组织样本的总RNA,通过荧光差异显示技术(DD-PCR)获得胃癌样品中差异的片段,对这些片段进行克隆和测序.通过在GenBank中同源性检索,查找与差异片段相对应的同源基因.利用半定量PCR及定量PCR方法验证该基因表达的差异性.结果:通过DD-PCR得到差异片段中的一个片段对应与人ATP/GTP结合蛋白1基因(A/GTPBP1).半定量PCR及荧光定量PCR技术检测结果表明,A/GTPBP1基因在胃癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织.该基因的读码框长3561bp,编码1186个氨基酸,分子质量为84.4kDa,蛋白质相似性分析表明该蛋白为G蛋白家族成员.结论:A/GTPBP1在胃癌组织中异常高表达,可能在胃癌发生过程中起调节作用。

小麦(Triticum asetivum L.)杂交种下调表达的GTP结合蛋白基因TaRab的克隆与鉴定

杂种优势的形成与杂种一代中亲本基因的表达方式改变有关.为深入研究小麦杂种优势形成的分子机理,利用通过抑制性差减杂交(SSH)方法获得的小麦Rab类GTP结合蛋白基因片段为探针,筛选普通小麦品系3338三叶期叶片cDNA文库,获得了一个小麦Rab家族基因TsRab. 同源性比较和序列分析显示,该基因与拟南芥Rab类GTP结合蛋白基因具有90%氨基酸序列相似性.结构分析表明,它具有GTP结合蛋白4个典型结构以及Rab家族成员特有的YYRGA结构域.半定量RT-PCR表达检测结果显示,TaRab基因在叶片的表达水平要高于其他组织器官.研究还发现,该基因在三叶期、分蘖盛期的根系和叶片中为杂种下调表达.采用电子定位方法,将TaRab基因初步定位在7B染色体的着丝粒区域和C-7DS5-0.36两个区域.在此基础上,对Rab 蛋白基因差异表达与杂种优势表现的关系进行了讨论.

小麦中小GTP结合蛋白基因TaRop2克隆及其表达分析

小GTP结合蛋白属于Rho家族,是植物特有的一类蛋白,在调控植物生长发育、抗逆和抗病过程中发挥着重要的作用。本研究通过筛选非亲和条锈菌小种CYR32侵染诱导的抗条锈病基因Yr5近等基因系(Taichung29*6/Yr5)c DNA文库,分离获得1个Rop家族基因的全长c DNA序列,命名为TaRop2(Triticum aestivum Rop2)。TaRop2包含1个591 bp的开放阅读框,预测编码含197个氨基酸残基的蛋白质,分子量为21.52 k D,理论等电点为9.49。通过在烟草表皮细胞瞬时表达,发现TaRop2分布于细胞核内和细胞膜上。RT-PCR分析结果表明,在高盐处理、非亲和条锈菌小种CYR32和亲和混合白粉菌菌株侵染时,TaRop2基因的表达水平升高,但被干旱、高温、低温和ABA处理抑制。说明TaRop2可能参与小麦防卫和抗逆反应过程。

流产布鲁氏菌ATP／GTP结合蛋白基因缺失株保护力及安全性研究

为筛选具有诊断标记的布鲁氏菌病疫苗菌株，本研究利用同源重组和负筛选技术，构建了流产布鲁氏菌株2308的ATP／GTP结合蛋白基因缺失株BDA14，并通过菌落染色和凝集特性，培养传代，小鼠接种试验及怀孕羊攻毒试验对其生物学特性、安全性和免疫效果进行了研究。

拟南芥H^+_-焦磷酸化酶AVP1互作小GTP结合蛋白AtRAB的特性鉴定与功能分析

以拟南芥AVP1为诱饵,采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与AVP1互作的小GTP结合蛋白AtRAB。酵母互作试验表明,AVP1和AtRAB存在互作;双分子荧光互补实验(BiFC)证明,AVP1和AtRAB能在质膜和细胞核上发生相互作用。野生型拟南芥(WT)、AtRAB和AVP1的拟南芥突变体rab和avp1在高盐胁迫条件下,随着NaCl浓度的加大,突变体rab和avp1的表型变化相似,相对于WT都表现为根长缩短,侧根数减少;在低磷处理条件下,随着磷浓度的逐渐降低,2个突变体的表型相似,相对于WT同样表现为根长缩短,总根面积减少,侧根数减少;在相同磷浓度条件下,突变体rab对胁迫的反应比avp1强;在低钾处理条件下,随着钾浓度的降低,2个突变体的表型与在低磷胁迫处理条件下的表型相似。结果说明,AVP1和AtRAB可以在细胞膜和细胞核上相互作用,AtRAB能够影响植物对离子的吸收,AVP1和AtRAB的突变体在高盐、低磷和低钾等胁迫条件下表型变化相似,证明了2个基因都正向调控植物对高盐、低磷和低钾胁迫的反应,它们属于同一信号途径。

诺氟沙星对海月水母螅状体Hsp70基因、GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因表达的影响

诺氟沙星(norfloxacin,NFLX)广泛应用于水产养殖中的鱼类细菌性疾病治疗。为探讨诺氟沙星对海洋生物的毒性作用,选择海月水母螅状体为受试生物,考察了不同浓度诺氟沙星和不同暴露时间对GTP结合蛋白(GTP binding protein)、氧化应激蛋白(oxidative stress protein)和热休克70 k Da蛋白(heat shock 70 k Da protein,Hsp70)表达量的影响。结果表明,NFLX对海月水母螅状体的48 h的半致死浓度(48 h-LC_(50))是415.1 mg·L^(-1),NFLX对海月水母螅状体的毒性属于低毒。随着NFLX浓度的升高和培养时间的延长,Hsp70基因在第7天浓度300 mg·L^(-1)时表达量受到显著性诱导(P<0.05),较对照组升高9.1倍;GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因的表达量都呈现先急剧升高后降低的趋势。2个基因均在第1天受到显著性诱导(P<0.05),分别在NFLX浓度100 mg·L^(-1)和300 mg·L^(-1)时表达量达到最大值,较对照组升高10.15倍和50.5倍。Hsp70基因、GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因在实验期间都对NFLX表现出较好的响应。

中性粒细胞小GTP结合蛋白的表达与冠心病发生关系的研究

目的 :探讨中性粒细胞活性氧的产生及小GTP结合蛋白Rac2和RhoGDI的差异性表达在冠心病 (GHD)发生发展中的作用。方法 :采用化学发光法检测活性氧 ,适时定量RT PCR检测调控中性粒细胞活性氧产生的两种小GTP结合蛋白Rac2和RhoGDImRNA表达量的变化。结果 :冠心病组中性粒细胞产生活性氧显著增多 ,冠心病人血清中各种炎性因子有促进中性粒细胞产生活性氧的作用 ;Rac2mRNA在冠心病组表达量显著性高于正常对照组 ,而RhoGDImRNA的表达量在两组中无显著区别 ,Rac2mRNA和RhoGDImRNA表达量的比值与中性粒细胞产生活性氧的峰值呈正相关。结论 :中性粒细胞通过产生活性氧参与冠心病的发生发展 ,冠心病病人中性粒细胞Rac2和RhoGDImRNA表达量比例失调是导致活性氧产生增多的重要因素。

金属离子对GTP结合蛋白Cdc42Hs的内源性GTP酶活性的影响

不同的金属离子会对GTP结合蛋白Cdc42Hs的内源性GTP水解酶活性产生不同的影响。相对于生理条件下的辅基Mg2 + 而言 ,Mn2 + 对Cdc42Hs酶活力有所激活 ,表现在饱和浓度时 ,实验曲线指数项的表观速率常数kobs 有2倍左右的提高 ,而其稳态反应速度要低于Mg2 +。Mg2 +和Mn2 +的实验曲线在本质上没有什么差别 ,都是一个指数项和一个一次项的叠加 ,说明Mn2 + 和Mg2 + 以相似的机制结合于Cdc42Hs。在Ca2 + 存在时 ,实验曲线无明显的指数项出现 ,Ca2 + 的存在仅使稳态反应速度有所降低 ,说明Ca2 + 以不同于Mg2 + 和Mn2 + 的机理与Cdc42Hs结合。随着Mg2 +和Mn2 +离子浓度的增大 ,指数项的表观速率常数kobs 逐步升高 ,稳态反应速度υs 逐渐降低。进一步的动力学模型分析得到了这一反应的微观动力学常数和Mg2 +、Mn2 +与蛋白的结合常数。

一种普遍存在的GTP结合蛋白——Ras蛋白

目前了解最清楚的GTP结合蛋白有两类:一是大肠杆菌中控制肽链延长的延伸因子EF-Tu,一是哺乳动物细胞中控制信号跨膜转导的G蛋白。在癌基因研究中,又发现有几十种蛋白质与Ras癌基因突变产生的Ras蛋白存在序列同源性。此文将对这类蛋白调节功能的近况作重点介绍。一、Ras蛋白的分类、结构和功能多数哺乳动物细胞有三种Ras蛋白:H-Ras、Ki-Ras和N-Ras。

免疫相关GTP结合蛋白2的亚细胞定位分析

目的:对免疫相关GTP结合蛋白2(GTPase of immunity-associated protein 2,GIMAP2)进行亚细胞定位分析,为深入研究GIMAP2蛋白的功能奠定基础。方法:使用国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库查询获取GIMAP2的蛋白序列,再利用生物信息学在线分析工具对GIMAP2蛋白的跨膜结构、核定位信号(nuclear localization signal,NLS)、核输出信号(nuclear export signal,NES)及亚细胞定位进行分析预测。采用PCR技术扩增GIMAP2基因片段,并插入至pQCXIP-mCherry-N1表达载体,用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。测序正确的重组质粒pQCXIP-GIMAP2-mCherry经过提取、纯化步骤后,与逆转录病毒包装质粒VSVG、Gag/Pol在脂质体介导下共同转入HEK293FT细胞中进行病毒包装。转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-436。使用免疫荧光染色方法检测内、外源性GIMAP2在MDA-MB-436胞内表达定位情况。使用绿色荧光化学染料分别标记稳定表达GIMAP2-mCherry融合蛋白的MDA-MB-436活细胞中的线粒体、内质网、脂滴,在超分辨率显微镜N-SIM下观察其与红色荧光的GIMAP2蛋白的定位情况。结果:生物信息学分析数据显示,由337个氨基酸组成的GIMAP2蛋白在羧基端可能有2个跨膜螺旋结构,其中跨膜螺旋含预期氨基酸数为40~41个,紧随跨膜螺旋结构之后的蛋白结构朝细胞质侧;羧基端第279~281位氨基酸有NES但无NLS;可能定位在内质网。测序结果表明,成功构建表达载体pQCXIP-GIMAP2-mCherry。荧光染色结果证实,GIMAP2-mCherry融合蛋白成功在MDA-MB-436细胞内表达,并与内源性GIMAP2定位一致,分布于内质网和脂滴。结论:免疫相关GTP结合蛋白2定位于内质网和脂滴,可能与脂代谢相关。

血小板活化中GTP结合蛋白的作用

血小板通过兴奋剂与细胞表面受体结合得以激活。血小板上存在两类GTP 结台蛋白,它们与血小板沽化有关。一类是G 蛋白,能调节兴奋剂受体与细胞酶的相互作用;另一类是低分子量结合蛋白,在其他细胞中与蛋白质运输、细胞活化和恶性转化有关,而在血小板中其作用尚不清楚。

延伸因子Tu GTP结合域蛋白2功能研究进展

延伸因子Tu GTP结合域蛋白2(elongation factor Tu GTP binding domain containing protein,EFTUD2)是剪接体复合物U5小核糖核蛋白的核心组件,通过调节剪接体的剪接功能进而调控相关基因的表达。本文旨在总结EFTUD2在免疫调节、胚胎发育和肿瘤进展等方面的重要作用。