抗麻痹性贝毒素GTX2,3单克隆抗体的制备及特性分析

制备抗麻痹性贝毒GTX2,3单克隆抗体。利用醛化法将GTX2,3与载体牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备完全抗原。免疫小鼠,取小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合。GTX2,3与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联作为检测抗原,用间接ELISA法筛选阳性克隆株。将筛选的阳性细胞株制备腹水。获得三株稳定分泌抗GTX2,3单克隆抗体的杂交瘤细胞株F4、F10、G9。间接ELISA法检测F10细胞株腹水抗体效价为1.4×10-5。半抗原GTX2,3与载体蛋白偶联后,作为免疫原,可制备高滴度的抗GTX2,3抗血清和单克隆抗体。该抗体对于藻毒素具有高特异性和高亲和力,可用于污染海产品的麻痹性贝毒的检测。

麻痹性贝类毒素GTX2,3间接与直接竞争酶免疫学检测方法的比较研究

目的：初步比较麻痹性贝类毒素GTX2，3间接竞争酶免疫学检测方法（idc—ELISA）与直接竞争酶免疫学检测方法（de—ELISA）。方法：用高碘酸盐氧化法制备GTX2，3-HRP偶联物并用直接ELISA对其进行鉴定。分别用GTX2，3与葡萄糖氧化酶（GOX）的偶联物GTX2，3-GOX和兔抗小鼠IgG多抗做为包被抗原，用GTX2，3标准毒素作为抑制剂，做间接及直接竞争ELISA，确定并比较两种ELISA的特异性、灵敏度、检测限、工作范围。结果：成功制备出GTX2，3-HRP偶联物，间接和直接竞争ELISA灵敏度分别为10μg／ml和4μg／ml，检测限为6．25μg／ml和0．5μg／ml，工作范围为6—50μg／ml和0．5—50μg／ml。结论：两种竞争ELISA都能应用于麻痹性贝类毒素的快速检测，但dc—ELISA比idc—ELISA更加灵敏，更适合于进一步的研究。

麻痹性贝类毒素GTX2,3模拟表位的初步研究

目的:利用噬菌体展示随机肽库筛选可模拟麻痹性贝类毒素GTX2,3抗原表位的噬菌体,初步鉴定人工合成的GTX2,3抗原表位肽的特异性。方法:以抗麻痹性贝类毒素GTX2,3单克隆抗体(mAb)为靶分子,对噬菌体随机12肽库进行3轮免疫亲和筛选,以夹心ELISA方法鉴定噬菌体克隆,竞争ELISA鉴定阳性噬菌体克隆的特异性。对阳性克隆进行DNA测序并推导噬菌体所展示的氨基酸序列。竞争ELISA鉴定模拟GTX2,3表位的合成肽的特异性。结果:经过3轮筛选获得20株能与靶分子高亲和力结合的阳性噬菌体克隆。序列分析表明DXLXPP为保守序列(X为任意氨基酸)。竞争ELISA检测表明,麻痹性贝类毒素GTX2,3可抑制阳性噬菌体克隆phage2与抗GTX2,3mAb结合。根据阳性序列合成的短肽可以抑制phage2与抗GTX2,3mAb的结合(IC50=13μg/mL)。结论:通过噬菌体肽库筛选技术,成功地获得麻痹性贝类毒素GTX2,3的模拟表位,并初步证实以此为基础合成的短肽能够准确和特异的模拟GTX2,3的表位。

麻痹性贝类毒素GTX2,3单克隆抗体在直接竞争ELISA检测方法中的应用

目的利用麻痹性贝类毒素GTX2,3单克隆抗体建立麻痹性贝类毒素GTX2,3直接竞争ELISA(dc-ELISA)检测方法。方法通过过氧化反应将GTX2,3与辣根过氧化物酶(HRP)偶联。以兔抗小鼠IgG多抗为包被抗体,GTX2,3为竞争剂,与GTX2,3-HRP竞争结合GTX2,3单克隆抗体,初步建立检测麻痹性贝类毒素GTX2,3的dc-ELISA,并用该方法检测GTX2,3单克隆抗体与C2毒素之间的交叉反应。结果直接ELISA检测证实GTX2,3与HRP偶联成功。dc-ELISA检测麻痹性贝类毒素GTX2,3的灵敏度为1.5μg/ml,工作范围为1.5～40μg/ml,GTX2,3毒素与C2毒素无交叉反应。该方法具有良好的特异性。结论dc-ELISA适用于麻痹性贝类毒素的快速检测。

膝沟藻毒素GTX2,3完全抗原的HPLC及免疫学鉴定

通过醛化法将膝沟藻毒素(GTX2,3)分别与血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联制备完全抗原,高效液相色谱法(HPLC)检测醛化反应前后游离GTX2,3的浓度,完全抗原免疫Balb/C小鼠,间接酶免疫吸附试验检测免疫后血清中抗体效价。GTX2,3与KLH及BSA偶联反应前溶液中毒素的浓度分别为760μg.mL-1和660μg.mL-1,偶联反应后毒素的浓度分别为191μg.mL-1及256μg.mL-1,Balb/C小鼠经过5次免疫后血清的效价为1:500。结果表明,反应后游离的GTX2,3的浓度降低,制备的GTX2,3完全抗原免疫小鼠后小鼠产生抗GTX2,3抗体,说明GTX2,3与载体蛋白发生偶联反应,偶联物具有免疫原性。