子房滴注法将GUS基因表达框转入大豆的研究

为了验证大豆子房滴注转化方法的可重复性与遗传稳定性,将由报告基因GUS、表达调控序列(35S启动子,NOS终止子)和T-DNA边界序列3部分组成的基因表达框转入大豆。对T0代转化材料进行GUS组织化学染色分析和PCR检测。结果表明:在检测的340个幼胚中有12个呈GUS阳性,且在180个转化植株中有6个呈PCR阳性同时其叶片也呈GUS阳性,转化率分别为3.53%和3.33%。Southern杂交表明外源GUS基因表达框以低拷贝的形式整合到大豆基因组中。对转基因后代叶片GUS染色、PCR分析及Northern blot检测结果表明外源基因已遗传给了后代,其中S2株系符合孟德尔分离规律。

转基因植物中报告基因gus的表达及其安全性评价

近十年来，植物转基因技术取得显著进展；许多转基因植物不断问世，其中报告基因ｇｕｓ在植 物基因工程和遗传转化中发挥着重要的作用。本文就ｇｕｓ基因的来源、在转基因植物中的表达及其生态 风险性与食品安全性作了简要综述。

白桦W-box元件的载体构建及驱动GUS基因表达分析

植物体内的启动子含有多种顺式作用元件,通过调控下游基因的表达,影响植物的生长发育。本研究以白桦中含有BplMYB46启动子的质粒为模板,将含有W-box元件的启动子短片段克隆出来,经过酶切、连接和热激转化到大肠杆菌中。经过PCR检测及测序分析,结果表明pCAMBIA1301-W-box-GUS重组载体构建成功。获得工程菌后,瞬时侵染烟草后进行GUS染色,结果显示,烟草叶片能被染色,但颜色较浅,说明W-box元件能够驱动GUS基因表达,但驱动能力较低。本研究为后续分析上游转录因子与W-box顺式作用元件的互作以及筛选诱导型启动子从而改良白桦品质提供前期基础数据。

利用GUS基因的瞬时表达优化大豆根癌农杆菌介导的遗传转化

高转化效率是分子育种的重要前提,根癌农杆菌介导的遗传转化由于其有较高的遗传效率和较低的拷贝数成为目前优选方法。为优化大豆遗传转化体系,以本实验室已有转化体系为基础,利用pCAMBIA3301中35S∶GUS基因瞬时表达体系,从萌发时间、切豆方法、侵染时间、共培养方式以及共培养时间等方面对东农47、垦农18和B12088大豆栽培品种的遗传转化体系进行优化。结果表明:东农47萌发1 d,侵染30 min;垦农18和B12088萌发12 h,侵染30 min,GUS基因瞬时表达率最高。在其它的处理上,3个品种表现结果一致,即蘸取菌液切豆,共培养中子叶伤口朝下摆放,黑暗条件下共培养3～5 d,GUS基因瞬时表达最高。3个品种在最适条件下,GUS染色效率均达到90%以上,垦农18遗传转化效率较高。本研究为大豆农杆菌介导子叶节转化方法提供了一个改进的方案,并且为拓宽可利用于大豆遗传转化的种质资源奠定基础。

农杆菌敏感小麦基因型的筛选研究

基因型是影响农杆菌转化植物的主要因素之一,筛选对农杆菌敏感的小麦基因型对于进一步提高小麦转化效率具有重要意义.利用c58C1农杆菌菌系(含GUS基因)感染不同小麦品种的幼穗和幼胚,共培养后进行X-Gluc组织化学染色检测,以筛选对农杆菌敏感的小麦基因型.结果表明,83个小麦基因型的幼穗经农杆菌感染后,GUS基因表达率66.7%～82.8%,CA9924、北农49、西农2611、京冬11等基因型对农杆菌感染比较敏感,多数基因型对农杆菌感染不敏感.80个小麦基因型的幼胚经农杆菌感染后,GUS基因表达率在10.0%以上的基因型仅占3.8%,没有GUS基因表达的基因型多达71.3%,绝大多数基因型对农杆菌感染不敏感;当幼胚与农杆菌的共培养在滤纸上进行时,97H2169、轮选208、兰考906、扬麦6号等基因型对农杆菌感染非常敏感,GUS基因表达率达到50.0%～93.3%,没有GUS基因表达的基因型下降到36.8%.表明不同小麦基因型以及相同基因型的不同外植体对农杆菌的敏感性存在着显著差异,兰考906、扬麦6号、西农2611、京冬11等基因型是农杆菌转化小麦较为理想的受体材料;滤纸上共培养方式更有利于农杆菌对小麦外植体的侵染,GUS基因表达率平均比固体培养基共培养方式高16.6个百分点.

高等植物ACC氧化酶基因启动子研究进展

启动子是控制植物基因表达的重要DNA序列结构,本文从高等植物ACO基因启动子克隆、顺式作用元件分析及GUS基因表达等方面着眼,综述该领域的研究进展。

基因枪转化玉米愈伤组织参数的优化

以玉米愈伤组织为受体 ,借助GUS基因的短暂表达 ,优化了PDS 10 0 0 /He型基因枪和自制基因枪的基因枪转化参数。PDS 10 0 0 /He型基因枪转化玉米愈伤组织的最佳轰击参数为 135 0psi压力 ,2 5In·Hg真空度 ,6cm射击距离。自制基因枪转化玉米愈伤组织的最佳轰击参数为0 6MPa 。

百合愈伤组织的诱导及瞬时表达的研究

以百合品种‘罗宾娜’(Robina)鳞片、花丝和花梗分化的不定芽为试材,诱导愈伤组织,并通过固体、液体和经过液体预培养后在固体上培养的方式继代增殖。结果表明:分化的不定芽在萘乙酸(NAA)0.5mg/L的培养基上愈伤组织的诱导率最高;从芽基部形成的愈伤组织以经过液体预培养后在固体上培养的方式继代,繁殖速率最大,再生率为100%。使用农杆菌介导转化pCAMBIAl301质粒后,3种不同方式培养的愈伤组织的GUS瞬时表达效率差异并不显著。

水稻金属硫蛋白基因(MT2bL)启动子的克隆与表达分析

金属硫蛋白(metallothionein,MT)富含半胱氨酸,而且能够结合多种金属离子,调控细胞内金属代谢的平衡。本研究根据水稻在减数分裂期、开花期和开花后5 d的基因芯片数据结果,从水稻品种黎榆B(O.sativa L.ssp.japonica C.V.Liyu B)基因组中克隆得到了一个植物MT-2类基因Metallothionein2b-Like(Os MT2b L)的启动子序列,序列全长2 063 bp。利用植物启动子区域顺式作用元件数据库(PLACE)分析表明该启动子序列含有5个CURE(copper-response element)元件(GTAC)以及多个其它顺式作用元件。构建了多个启动子融合表达载体(p Ca MV35S::GUS,p MT2b L::GUS,p Ubi1::GUS,p CYC::GUS和p ACT1::GUS),并通过根癌农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得了转基因植株。GUS组织染色结果分析表明,Os MT2b L基因启动子在水稻幼苗期的胚根、胚芽和胚芽鞘中具有高水平的GUS表达活性,特别是在胚根根尖和胚芽顶端的GUS表达活性较高;在减数分裂期的植株叶片、颖壳和开花10 d后的未成熟种子中GUS表达活性也较高;GUS蛋白荧光定量分析结果表明,Os MT2b L基因启动子在水稻叶片中驱动GUS基因表达的活性比Ca MV35S基因启动子高出3倍以上。

启动子陷阱技术在橡胶树中的应用研究

启动子陷阱技术是克隆未知基因启动子的有效途径。首先用反向无启动子的GUSA替换pCAMBIA-2301载体上的GUSA及启动子序列,构建橡胶树启动子陷阱载体pCAMBIA2301:GUS-NOS,然后转化橡胶树。结果表明:获得了GUS染色阳性胚状体6个,再生后获得2个转基因株系。其中1个株系在胚状体、叶片和根中能检测到GUS基因的强烈表达,另1个株系仅在根中检测到微弱的GUS基因表达,说明获得的转基因植株为不同启动子启动GUS基因的株系。因此通过橡胶树启动子陷阱载体的构建及其在橡胶树中的表达,能够发现和克隆橡胶树内源基因的启动子。

高羊茅和黑麦草农杆菌介导转化体系的研究

利用C58C1农杆菌菌系(携带的表达载体上含GUS基因和nptII基因)感染4个草坪草品种追寻者、爱神特、腾跃和守门员成熟胚来源的愈伤组织,共培养后部分愈伤组织进行X-Gluc组织化学染色检测,其余愈伤组织在含G41810～25mg/L的MS改良培养上先后筛选抗性愈伤组织和分化抗性再生植株,对移栽成活的144棵抗性再生植株分别进行了ELISA检测、PCR检测和组织化学染色检测。愈伤组织阶段X-Gluc染色检测结果表明,4个草坪草品种GUS基因瞬间表达率8.6%～46.9%,爱神特愈伤组织对农杆菌侵染最为敏感,其次是腾跃和守门员,追寻者最不敏感;ELISA检测结果表明,45株呈现阳性,证明nptII基因已转入草坪草并已表达;PCR检测结果与ELISA检测结果一致,表明nptII基因确实已经整合到了草坪草基因组中,且没有发生沉默现象;转基因植株X-Gluc染色检测结果表明,GUS基因在43株中得到了稳定表达,在2株中发生了沉默现象。4个草坪草品种抗性再生植株分化率0%～43.5%,转化率0%～21.5%。结果还表明,GUS基因瞬间表达率与稳定转化率在草坪草上很不一致,不能作为衡量基因型转化效果的指标。

烟草NtGCN2启动子的克隆及功能研究

【目的】探究烟草蛋白激酶NtGCN2启动子驱动GUS基因在ABA、SA、AZA和MeJA四种处理下的表达模式。【方法】克隆烟草NtGCN2上游2000 bp的启动子序列,并采用Plant CARE和PLACE数据库进行顺式作用元件预测。构建NtGCN2启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的融合表达载体并转化烟草K326。利用获得NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS的转基因植株,探究NtGCN2启动子驱动的GUS报告基因在ABA、SA、AZA和MeJA四种激素处理下的表达模式。【结果】顺式作用元件预测结果发现,在NtGCN2-Nsy-pro2000上存在多种顺式作用元件,如脱落酸应答元件(ABRE)、茉莉酸甲酯应答元件(TGACG-motif)等。ABA、SA和AZA处理下NtGCN2启动子驱动的GUS基因表达和酶活性均显著增加,而MeJA处理下NtGCN2启动子驱动的GUS基因表达及酶活性下降。【结论】NtGCN2上游2000 bp序列具有启动子活性,NtGCN2-Nsy-pro2000驱动GUS基因在不同激素处理下呈现不同的响应模式。ABA、SA和AZA激活NtGCN2-Nsy-pro2000驱动的GUS基因表达,而MeJA抑制NtGCN2-Nsy-pro2000驱动的GUS基因表达。

甜玉米愈伤组织遗传转化条件优化研究

利用gus基因瞬时表达技术比较了根癌农杆菌和基因枪两种转化方法,在不同的条件下对甜玉米愈伤组织遗传转化率影响。结果表明,根癌农杆菌培养浓度OD_(600)值达到1.164、稀释浸染浓度OD_(600)值为0.30时,gus基因的瞬时表达率最高,为57.692%;农杆菌侵染愈伤组织过程中,在真空度为-10 mMPa下处理5 min,转化率略有提高。在基因枪转化中,氦气压力与射程对转化率有较大影响,在压力为1100 psi、射程为6 cm时,gus基因的瞬时表达率最高,转化率为58.333%。