大豆GmWRI1a基因启动子克隆及其功能分析

为了探究大豆种子油脂合成与储存基因GmWRI1a的调节,分析其启动子功能,从大豆品种东农50基因组中扩增获得GmWRI1a基因转录起始位点上游1669bp的启动子序列,转化拟南芥。GUS染色确定了启动子的有效性,继而根据顺式作用元件的分布,分别扩增得到4个启动子5'端缺失片段1138bp,1087bp,690bp和437bp。4个启动子缺失片段分别转化拟南芥后,通过GUS组织染色结果发现,这些启动子片段能够驱动下游GUS基因表达。GUS酶活表明,启动子存在乙烯、茉莉酸、赤霉素3种激素响应元件,其中乙烯、茉莉酸和赤霉素的响应元件分别分布在-1138^-1087bp、-1087^-690bp和-690^-437bp。

Cre-lox重组系统介导转基因烟草中外源基因删除的研究

对Cre在转基因个体中介导的重组效率进行了研究。构建了含有Cre基因 (p35S Cre)和GUS基因侧翼含同向loxP位点的 (loxP p35S GUS loxP)两种植物表达载体。以共转化的技术将两种基因元件同时转化烟草得到转基因植株 ,根据对共转化植株GUS基因的活性分析、分子检测、PCR检测及对重组后扩增DNA片段进行序列分析表明 :Cre loxP重组系统在转基因烟草中能精确高效地介导转基因的删除 ,但也存在部分植株不能完全删除的现象。

玉米醇溶蛋白ze19基因启动子克隆与功能分析

从玉米自交系9801基因组DNA中克隆玉米醇溶蛋白基因ze19启动子,将其克隆到pMD18-T载体上。该序列与发表序列同源性为94%,包括TATAbox、CAATbox启动子基本元件以及多种参与调节醇溶蛋白表达的顺式元件。将ze19启动子取代质粒PBI121-gus中的CaMV35S启动子,构建由ze19启动子驱动GUS的植物表达载体pBIze19-gus,利用土壤杆菌介导法将重组载体pBIze19-gus转入烟草中。对转基因烟草植株GUS活性的定性与定量分析结果表明,ze19启动子驱动GUS基因在转基因烟草种子中表达活性最高,在叶片中活性很弱,在茎中没有活性。所克隆的ze19启动子具有种子特异表达特性,为玉米种子生物反应器的研究提供借鉴。

木质部特异性启动子缺失片段的克隆及功能分析

木质部特异性启动子可使外源基因在木质部中进行高效表达,本试验采用5'端系列缺失分析法,通过PCR扩增出杨树木质部特异性启动子MDCes AP中与其转录起始位点距离不同的5'端缺失的启动子片段MU2、MU4。将扩增片段替换植物特异性表达载体p BI121中的Ca MV35S启动子,使每个基因片段与载体中GUS报告基因相连得到重组质粒并转入农杆菌。通过烟草瞬时转化检测结果表明,缺失片段MU2、MU4均具有启动子功能,且两者活性均显著高于Ca MV35S启动子,并具有木质部组织特异性。木质部特异启动子结构特征和功能的深入研究将为确定其中决定木质部组织特异性的必要元件以及其他具有诱导活性的顺式作用元件奠定基础,从而为利用这些顺式作用元件调控外源基因在特定的时间、特定的组织器官高效表达提供可能。

水稻GluB-4终止子的克隆与功能分析

目前转基因常用的终止子大多为细菌或真菌来源,有可能引起转基因食品安全性问题。本研究以水稻(Oryzasativa)‘kitaake’为材料,克隆了谷蛋白B-4基因(GluB-4)的终止子GluB-4-T(GenBank登记号:X14393),分析了其在不同启动子驱动下替代根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶终止子(nos-T)的可能性。β-d-葡糖醛酸酶(GUS)组织化学染色结果表明, GluB-4-T在GluB-3启动子驱动下,未改变GluB-3启动子的组织表达特异性,但GUS表达强度发生了改变; GUS活性分析显示GluB-4-T GUS活性是nos-T的2.4倍。为验证GluB-4-T增强外源基因表达的特性不依赖于上游启动子序列,将其克隆到强的胚乳特异性启动子GluC和组成型启动子OsActin下, GUS活性分别是nos-T的2.0和2.2倍,说明GluB-4-T增强外源基因表达的特性不依赖于上游启动子序列。以上结果表明GluB-4-T在水稻体内发挥正常的转录终止活性,且比nos-T表达活性强,可以作为有效终止子用于遗传转化,避免多基因转化系统中由于转基因同源性过高引起的转基因沉默现象。该结果为实现外源目的基因在水稻胚乳中特异表达提供理论依据。