二烯丙基二硫通过磷酸化Chk1负调控Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路阻滞白血病K562细胞G_(2)/M期

目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病K562细胞周期阻滞及其分子机制。方法:采用CCK-8、细胞计数及流式细胞术观察DADS对K562细胞增殖与周期阻滞效应。Western Blot检测DADS对K562细胞PCNA、Chk1/2以及下游分子Cdc25C、CyclinB1与CDK1表达的影响。结果:CCK-8检测显示,15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L DADS处理后,呈浓度依赖性抑制K562细胞增殖,抑制率分别为32.48%、59.34%、66.42%、77.06%、81.05%(P<0.05)。对照组与Tween80组无抑制作用(P>0.05)。细胞计数结果显示,30μmol/L、60μmol/L与120μmol/L DADS处理K562细胞后,群体倍增时间分别为22.71±0.29、36.69±0.93与73.02±0.87呈浓度依赖性增加(P<0.05),而Tween80组与对照组无明显差异(P>0.05)。流式细胞术检测显示,60μmol/L与120μmol/L DADS作用K562细胞24 h与48 h后,G_(2)/M期百分率分别增加到17.6%与28.5%和18.6%与34.4%,较对照组有显著性差异(P<0.05)。60μmol/L DADS作用K562细胞1 h、2 h、4 h、8 h和24 h后,PCNA表达呈时间依赖性表达下调(P<0.05)。p-Chk1表达呈时间依赖性上调(P<0.05),而Chk1、Chk2与p-Chk2表达无明显差异(P>0.05)。并且,Cdc25C、CyclinB1和CDK1分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但是,14-3-3蛋白无明显改变(P>0.05)。结论:DADS可磷酸化Chk1通过Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路抑制K562细胞增殖与阻滞G_(2)/M期。

Ethanol extract of Kalopanax septemlobus leaf inhibits HepG2 human hepatocellular carcinoma cell proliferation via inducing cell cycle arrest at G_1 phase

Objective:To investigate the effects of an ethanol extract of Kalopanax septemlobus(Thunb.)Koidz.leaf(EEKS) on cell proliferation in human hepatocellular carcinoma cells and its mechanisms of action.Methods:Cells were treated with EEKS and subsequently analyzed for cell proliferation and flow cytometry analysis.Expressions of cell cycle regulators were determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction analysis and Western blotting,and activation of eyclin-associaled kinases studied using kinase assays.Results:The EEKS suppressed cell proliferation in both HepG2 and Hep3 B cells,but showed a more sensitive anli-proliferative activity in HepG2 cells.Flow cytometry analysis revealed an association between the growth inhibitory effect of EEKS and with G_1 phase cell cycle arrest in HepG2 cells,along with the dephosphorylation of retinoblastoma protein(pRB) and enhanced binding of pRB with the E2 F transcription factor family proteins.Treatment with EEKS also increased the expression of cyclin-dependent kinase(CDK) inhibitors,such as p21WAF1/CIP1 and p27KIP1.without any noticeable changes in G_1 cyclins and CDKs(except for a slight decrease in CDK4).Treatment of HepG2 cells with EEKS also increased the binding of p21 and p27 with CDK4 and CDK6.which was paralleled by a marked decrease in the cyclin D- and cyclin E-associated kinase activities.Conclusions:Overall,our findings suggest that EEKS may be an effective treatment for liver cancer through suppression of cancer cell proliferation via G_1,cell cycle arrest Further studies arc required to identify the active compounds in EEKS.

中药黄芪饮片中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的UPLC-MS/MS分析测定

目的:通过超高效液相色谱-串联质谱法建立对中药黄芪饮片中黄曲霉毒素的含量的测定,了解中药黄芪饮片的质量安全状况。方法:样品经乙腈-水(体积比70:30)提取、离心后得到的上清液用磷酸盐缓冲溶液稀释后通过免疫亲和柱净化和富集,洗脱液过滤后,经优化流动相后反相色谱分离,串联质谱检测,内标法定量。结果:采用5mmoL/L甲酸铵溶液(含0.1%甲酸)和乙腈:甲醇=1:1(含0.1%甲酸)作流动相时,黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的标准曲线相关系数R^(2)分别是0.9986、0.9996、0.9984、0.9970;其加标回收率分别为105%、95.4%、107%、98.8%;RSD在2.46%~4.90%;其方法检出限为0.06ug/kg,定量限为0.20ug/kg。结论:超高效液相色谱-串联质谱法简单快速,灵敏度高,精密度高,可满足大批量中药黄芪饮片中黄曲霉毒素含量测定的需要以及对其它中药材的检测参考方法;利用此法对50份中药黄芪饮片中黄曲霉毒素B、B_(2)、G_(1)、G_(2)进行抽检,其B_(1)、B_(2)检出率分别为4%、4%,G_(1)、G_(2)未检出。

黄连素通过诱导G_(0)/G_(1)或G_(2)/M期阻滞抑制前列腺癌细胞株PC-3的增殖作用分析

目的观察黄连素在体外对前列腺癌细胞株PC-3的抑制及凋亡的诱导,并进一步探讨其作用机制。方法采用MTT法检测不同浓度黄连素对前列腺癌细胞株PC-3的增殖抑制作用,采用流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡,通过PI染色法结合流式细胞仪检测黄连素对前列腺癌细胞株PC-3细胞周期的影响;蛋白免疫印迹(WB)方法检测黄连素作用于前列腺癌细胞株PC-3后细胞中脂肪酸合成酶(FAS)蛋白的表达。结果黄连素组前列腺癌PC-3细胞株增殖抑制率及凋亡率均高于未加入黄连素组,且随着黄连素浓度的上升,前列腺癌PC-3细胞株增殖抑制率及凋亡率均逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。黄连素孵育24 h组、黄连素孵育48 h组、黄连素孵育72 h组的前列腺癌PC-3细胞株在G_(0)/G_(1)期比例高于对照组,在S期与G_(2)/M期比例低于对照组,且随黄连素孵育时间增加,前列腺癌PC-3细胞株在G_(0)/G_(1)期比例明显增加,在S期与G_(2)/M期比例逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05)。黄连素不同孵育时间及不同浓度均对前列腺癌PC-3细胞株中FAS蛋白存在影响,且随着孵育时间的延长与浓度的增加,FAS蛋白含量均逐渐减少。结论黄连素可通过诱导细胞G_(2)/M期阻滞和抑制前列腺癌PC-3细胞株中FAS蛋白表达对前列腺癌细胞株PC-3的增殖生长及凋亡起到抑制与促进作用,且与时间、浓度呈依赖性。

电离辐射诱导EL-4淋巴瘤细胞G_1期阻滞及相关蛋白的表达

探讨X射线诱导EL 1细胞G1期阻滞及相关蛋白的表达。采用PI荧光标记 ,流式细胞术检测细胞周期的变化。用单克隆抗体免疫荧光标记 ,流式细胞术检测蛋白表达的变化。结果表明 ,2 0Gy和 4 0Gy照射后 12 72h ,G1期EL 4细胞百分数显著高于假照射组 ( p <0 0 5- p <0 0 0 1)。 4 0Gy照射后EL 4细胞 p53蛋白表达从照射后 2h开始明显增高 ,持续至照射后2 4h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1) ;p2 1蛋白表达在照射后 2h开始明显增高 ,持续至照射后 4 8h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1) ;GADD4 5蛋白表达在照射后 2h开始明显增高 ,持续至照射后 4 8h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1) ;MDM 2蛋白表达在照射后 4h开始明显增高 ,持续至照射后 2 4h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1)。结果提示 ,中等剂量X射线照射可诱导EL 4细胞G1期阻滞。p53、p2 1和GADD4 5蛋白表达在电离辐射诱导EL

Mcl-1在二烯丙基二硫诱导人白血病HL-60细胞G_2/M阻滞中的作用

目的:探讨Mcl-1在二烯丙基二硫(DADS)诱导人白血病HL-60细胞周期阻滞过程中的作用。方法:CCK-8检测DADS抑制HL-60细胞的作用;流式细胞术观察DADS对HL-60细胞的周期阻滞效应;West-ern blotting分析DADS处理HL-60细胞后Mcl-1、PCNA(细胞核增殖抗原)、CDK1(周期依赖激酶1)表达情况;RNAi干扰Mcl-1观察Mcl-1对白血病细胞周期的影响;免疫共沉淀分析Mcl-1与PCNA、CDK1结合作用。结果:CCK-8比色结果显示,15、30、60、120、240μmol/L DADS处理HL-60细胞,细胞增殖抑制率分别为31.15%、55.88%、66.14%、75.29%、80.35%,呈浓度依赖性增加(P<0.05)。流式细胞术检测显示,60μmol/L和120μmol/L DADS作用HL-60细胞24 h和48 h后,呈时间和浓度依赖性诱导HL-60细胞G2/M期阻滞(P<0.05)。Western blotting分析发现60μmol/LDADS处理HL-60细胞后PCNA、Mcl-1、CDK1表达下调(P<0.05)。Mcl-1基因沉默24 h后G2/M期百分率增加到19.4%,与对照组比较有显著差异(P<0.05)。而Mcl-1基因沉默后加入60μmol/L DADS作用时,G2/M期百分率比60μmol/L DADS处理组增加6.0%(P<0.05)。免疫共沉淀发现,HL-60细胞中存在Mcl-1与PCNA、CDK1的相互结合,DADS处理HL-60细胞后Mcl-1与PCNA、CDK1的结合作用减弱。结论:DADS能诱导HL-60细胞增殖抑制和G2/M阻滞,其抑制增殖作用与PCNA表达下调有关。Mcl-1基因沉默可增强DADS对HL-60细胞G2/M期阻滞作用。

HIV-1初始传播病毒Vpr基因遗传变异对诱导G_2期阻滞及细胞凋亡的影响

人免疫缺陷病毒(HIV-1)急性感染过程中,病毒的遗传多样性显著减少,往往只有一株或几株病毒可以建立有效感染,这种病毒被称为初始传播病毒(Transmitted/Founder virus)。病毒蛋白R(Vpr)是HIV-1的辅助蛋白之一,在病毒复制过程中起重要作用。研究初始传播病毒Vpr基因遗传变异与生物学特征对于阐明病毒建立感染的关键环节具有重要意义。文章利用流式细胞术分析了C亚型HIV-1初始传播病毒株与慢性感染株MJ4的Vpr蛋白诱导细胞G2期阻滞和细胞凋亡的能力。结果显示,初始传播病毒ZM246和ZM247的Vpr诱导细胞G2期阻滞和细胞凋亡的能力显著高于慢性感染株MJ4 Vpr。氨基酸序列分析表明,初始传播病毒Vpr在第77、85和94位上存在高频突变。研究结果提示初始传播病毒可能在病毒感染早期,通过Vpr基因的遗传突变,提升病毒诱导细胞停滞G2期和细胞凋亡的能力,进而促进病毒在宿主体内的复制和传播。

p16负向调控通路与辐射诱导的G_1期阻滞

辐射诱导细胞发生G1期阻滞,其分子调控机制尚不十分清楚。近期文献报道,独立于p53基因之外的p16-Cyclins-CDKs(细胞周期素依赖性激酶)细胞周期负向调控通路在紫外线和电离辐射照后发生改变,提示此通路可能在辐射诱导的G1期阻滞中发挥至关重要的作用。

酒东油田深层K_(1)g_(3)砂岩成岩演化与优质储层分布

针对酒泉盆地酒东油田深层K_(1)g_(3)砂岩优质储层分布规律不明确的问题,通过铸体薄片、扫描电镜、物性等资料,开展成岩特征、成岩演化、成岩相与优质储层分布等研究。结果表明:酒东油田深层K_(1)g_(3)砂岩具有3类成岩特征,且Ⅱ、Ⅲ类成岩特征的砂岩是由Ⅰ类含铁白云石胶结致密砂岩在酸性溶蚀流体差异化作用下形成。酸性溶蚀流体有3期,前2期为大气淡水,第3期为有机酸流体,对砂岩溶蚀作用贡献最大的酸性流体是第2期大气淡水。K_(1)g_(3)砂岩可以划分为4类成岩相和2个成岩相带,B类成岩相为高孔高渗优质储层,D类成岩相为中孔低渗差储层,A、C类成岩相为含铁白云石胶结致密非储层;长2断层以西的主产油区为B类成岩相带,以东的扩边区为D类成岩相带,A、C类成岩相总体不发育。该成果可为酒东油田开发方案调整和扩边勘探部署提供依据。

桑黄水提物诱导黑色素瘤细胞系B16-F10 G_(0)/G_(1)期阻滞的研究

通过噻唑蓝(MTT)比色法、流式细胞分析、转录组测序和蛋白印迹等手段,探究桑黄水提物(SH)对黑色素瘤细胞系B16-F10的抑制作用及分子作用机制。MTT实验结果显示,SH能够抑制B16-F10细胞系增殖,且呈剂量依赖性。流式细胞分析发现,SH能够诱导细胞G_(0)/G_(1)期阻滞,但对细胞凋亡无明显影响。RNA-seq、qRT-PCR和Western blot分析发现,SH主要通过上调p53信号通路中p21的表达,进而抑制细胞周期通路中CyclinD3、CDK2和CDK6的表达来影响细胞周期阻滞。研究结果证明SH对黑色素瘤细胞增殖具有显著的抑制作用,p21-CyclinD3-CDKs信号通路介导的G_(0)/G_(1)期阻滞是其作用机制之一。

DNA吸附消除黄曲霉毒素G_(1)

鉴于黄曲霉毒素G1(AFG_(1))的毒性强,难降解和有效去除,利用AFG_(1)与DNA的嵌插结合,构建选择性吸附消除AFG_(1)的有效方法。AFG_(1)嵌入DNA的最佳反应条件为pH 7.4及30℃,其DNA结合饱和值和去除率为1.66、88.14%。添加NaCl、CaCl_(2)、L-天冬氨酸、葡萄糖、尿素、亮氨酸、赖氨酸、维生素C等后,DNA结合饱和值分别为1.45、1.45、1.29、1.05、1.95、1.95、2.32和2.90。去除率分别为78.08%、76.44%、75.92%、75.16%、88.41%、88.67%、88.87%、90.27%。NaCl、CaCl_(2)、L-天冬氨酸、葡萄糖等负电基团或者离子强度较高不利于AFG_(1)-DNA嵌插结合,而尿素、亮氨酸、赖氨酸、维生素C等带正电基团和相似基团的物质利于AFG_(1)-DNA的嵌插结合。花生油中的AFG_(1)的去除率达到80%以上。动力学相关系数和吸附容量可知,该吸附过程符合准二级动力学模型,表明吸附过程的限速步骤为化学相互作用。吸附过程遵循Freundlich等温吸附模型,该吸附过程为多层吸附。热力学结果显示DNA对AFG_(1)的吸附是自发的放热过程。综上,DNA能选择性吸附AFG_(1),因此,可进一步开发DNA新型材料,在去除食品中黄曲霉毒素方面有重要意义。

Intrinsic apoptotic pathway and G2/M cell cycle arrest involved in tubeimoside I-induced EC109 cell death

Objective： Squamous esophageal carcinoma is highly prevalent in developing countries, especially in China. Tu Bei Mu （TBM）, a traditional folk medicine, has been used to treat esophageal squamous cell carcinoma （ESCC） for a long term. tubeimoside I （TBMS1） is the main component of TBM, exhibiting great anticancer potential. In this study, we investigated the mechanism of TBMS1 cytotoxic effect on EC109 cells. Methods： Comparative nuclear proteomic approach was applied in the current study and we identified several altered protein spots. Further biochemical studies were carried out to detect the mitochondrial membrane potential, cell cycle and corresponding proteins＇ expression and location. Results： Subcellular proteomic study in the nucleus from EC109 cells revealed that altered proteins were associated with mitochondrial function and cell proliferation. Further biochemical studies showed that TBMSl-induced molecular events were related to mitochondria-induced intrinsic apoptosis and P21-cyclin B 1/cdc2 complex-related G2/M cell cycle arrest. Conclusions： Considering the conventional application of TBM in esophageal cancer, TBMS1 therefore may have a great potential as a chemotherapeutic drug candidate for ESCC.

Paris chinensis dioscin induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis in human gastric cancer SGC-7901 cells

AIM:To investigate the anti-tumor effects of Paris chinensis dioscin(PCD)and mechanisms regarding cell cycle regulation and apoptosis in human gastric cancer SGC-7901 cells.METHODS:Cell viability was analyzed by the 3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide assay.Cell apoptosis was evaluated by flow cytometry and laser scanning confocal microscope(LSCM)using Annexin-V/propidium iodide(PI)staining,and the cell cycle was evaluated using PI staining with flow cytom-etry.Intracellular calcium ions were detected under fluorescence microscope.The expression of cell cycle and apoptosis-related proteins cyclin B1,CDK1,cytochrome C and caspase-3 was measured by immunohistochemical staining.RESULTS:PCD had an anti-proliferation effect on human gastric cancer SGC-7901 cells in a dose-and time-de-pendent manner.After treatment of SGC-7901 cells with PCD,apoptosis appeared in SGC-7901 cells.Morpho-logical changes typical of apoptosis were also observed with LSCM by Annexin V/PI staining,and the cell number of the G0/G1 phase was decreased,while the number of cells in the G2/M phase was increased.Cell cycle-related proteins,such as cyclin B1 and CDK1,were all down-regulated,but caspase-3 and cytochrome C were up-regulated.Moreover,intracellular calcium accumulation occurred in PCD-treated cells.CONCLUSION:G2/M phase arrest and apoptosis induced by PCD are associated with the inhibition of CDK-activating kinase activity and the activation of Ca2+-related mitochondrion pathway in SGC-7901 cells.

灰葡萄孢产孢相关基因BC1G__03293功能的初步研究

据灰葡萄孢菌丝发育和菌核形成时期的RNA-seq数据,挑选出在这2个时期表达量差异较大的基因BC1G__03293进行基因功能的研究。结果发现,BC1G__03293在菌核发育时期表达明显上调,表达量比菌丝生长时期上调了70倍以上。该基因编码的蛋白质含有229个氨基酸,N端包含信号肽,但不含有任何已知保守结构域。通过同源重组的方法得到了BC1G__03293的敲除转化子ΔBC1G__03293-2和ΔBC1G__03293-4,并运用农杆菌转化技术得到了互补转化子ΔBC1G__03293-2-C2和ΔBC1G__03293-2-C3。BC1G__03293基因敲除后生长、致病及菌核形成等表型无明显变化,但敲除转化子的分生孢子产量显著下降,仅为野生型菌株B05.10分生孢子产量的45%,并且BC1G__03293基因互补可使敲除转化子的产孢量得到明显恢复。结果说明BC1G__03293基因与灰葡萄孢的分生孢子形成相关。

HPLC-MS/MS法测定化妆品中黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)、B_(1)

建立高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定化妆品中黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)、B_(1)的方法。化妆品经70%甲醇提取并经免疫亲和柱净化,采用C_(18)柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm),流动相体系为2.0 mmol/L乙酸铵甲醇溶液(含0.1%甲酸)和2.0 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸),流速为0.3 mL/min进行梯度洗脱,扫描方式为正离子多反应监测模式(MRM)。黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)、B_(1)在一定浓度范围内线性关系均良好,相关系数不低于0.998。检出限范围为0.028~0.078 ng/g。精密度及稳定性均良好,回收率85.0%~96.2%。该方法准确、高效,为化妆品中黄曲霉毒素的测定提供了技术支持。

Chaga mushroom (Inonotus obliquus) induces G0/G1 arrest and apoptosis in human hepatoma HepG2 cells

AIM: To investigate the anti-proliferative and apoptotic effects of Chaga mushroom (Inonotus obliquus) water extract on human hepatoma cell lines,HepG2 and Hep3B cells. METHODS: The cytotoxicity of Chaga extract was screened by 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Morphological observation,flow cytometry analysis,Western blot were employed to elucidate the cytotoxic mechanism of Chaga extract. RESULTS: HepG2 cells were more sensitive to Chaga extract than Hep3B cells,as demonstrated by markedly reduced cell viability. Chaga extract inhibited the cell growth in a dose-dependent manner,which was accompanied with G0/G1-phase arrest and apoptotic cell death. In addition,G0/G1 arrest in the cell cycle was closely associated with down-regulation of p53,pRb,p27,cyclins D1,D2,E,cyclin-dependent kinase (Cdk) 2,Cdk4,and Cdk6 expression. CONCLUSION: Chaga mushroom may provide a new therapeutic option,as a potential anticancer agent,in the treatment of hepatoma.

HPLC法测定小儿扶脾颗粒中黄曲霉毒素B_1、B_2、G_1、G_2含量

目的:建立高效液相色谱法测定小儿扶脾颗粒中黄曲霉毒素B_1、B_2、G_1、G_2的含量,并通过对31批样品检测结果的分析初步研究小儿扶脾颗粒在黄曲霉毒素污染方面的安全性,以提示企业选择安全的原料药材投料。方法:采用柱后光化学衍生HPLC法测定小儿扶脾颗粒中黄曲霉毒素的含量。采用Ecosil C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-水(30∶10∶60),荧光检测器,激发波长为360 nm,发射波长为450 nm,流速为0.8 ml·min^(-1),柱温为30℃进样量为20μl。结果:黄曲霉毒素B_1、B_2、G_1、G_2分别在9.65~48.25 pg(r=0.999 1)、2.45~12.25 pg(r=0.999 8)、10.5~52.5 pg(r=0.995 6)、2.55~12.75 pg(r=0.996 6)范围内线性关系良好;加样回收率在83.3%~95.6%之间。有14批样品检出黄曲霉毒素,其总含量为0.21×10^(-3)~0.54×10^(-3)μg·g^(-1)。结论:该方法操作简便,结果稳定可靠,可用于小儿扶脾颗粒的质量控制。

启脾丸中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)含量测定及安全性评价

目的建立高效液相色谱法测定启脾丸中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的含量,并评价启脾丸中黄曲霉毒素安全性。方法样品提取后通过免疫亲和柱处理,采用HPLC-柱后衍生-FLD法对全国10个生产企业的64批启脾丸进行测定。结果启脾丸中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的平均回收率为84.09%、84.38%、83.11%、86.33%,RSD为2.5%、2.0%、2.8%、1.9%,64批启脾丸中52批检出黄曲霉毒素,检出率为81.2%,不合格率为9.4%,部分样品存在黄曲霉毒素污染的问题。结论该方法操作简便,结果稳定可靠,可为该制剂的质量安全控制提供依据。

UPLC-MS/MS测定健脾丸中的黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)和B_(1)

建立了超高效液相色谱串联四级杆质谱法(UPLC-MS/MS)测定健脾丸(大蜜丸和小蜜丸)中黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)和B_(1)的含量的方法。样品经75%的甲醇提取和免疫亲和柱净化后,以超高效液相色谱串联四级杆质谱进行分析测定。黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)和B_(1)分别在0.0304~3.040 ng/mL(r=0.9998)、0.0848~8.480(r=0.9996)、0.0344~3.440(r=0.9996)、0.0816~8.160(r=0.9996)范围内线性关系良好;加样回收率在86.6%~91.7%之间。12批样品检出黄曲霉毒素。该法灵敏、快速、准确,专属性强,可用于测定健脾丸(大蜜丸和小蜜丸)中黄曲霉毒素。

苹果树腐烂病菌丝氨酸蛋白酶基因VM1G_08720的功能分析

苹果是我国种植面积最广的温带水果之一,由苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali)引起的苹果树腐烂病(Valsa canker of apple)是危害我国苹果树最为严重的病害之一。明确病原菌生长发育、响应环境胁迫及致病作用,解析病原菌的适应性及致病分子机制,有利于提出病害新的防控措施。本研究应用Double-joint PCR以及gap-repair方法获得基因VM1G_08720的缺失突变体和回补菌株。利用十字交叉法和伤口接种等方法,研究了基因VM1G_08720对病菌生长发育和致病性的影响。通过在PDA培养基中分别添加400μg/mL的荧光增白剂、200μg/mL的刚果红、0.01%的SDS三种细胞壁干扰剂和0.5M的NaCl、0.5M山梨醇两种渗透胁迫因子,研究了该基因对病菌细胞壁完整性的维持及渗透胁迫的影响。通过设置不同pH的培养基,研究了基因VM1G_08720在不同pH下对病菌生长发育的影响。研究结果显示,与野生型sdau11-175相比,基因VM1G_08720缺失突变体在菌落颜色、菌丝致密度、生长速率无显著差异,分生孢子器产生数量减少;在含有200μg/mL刚果红、0.01%SDS的培养基上,抑制率显著降低,在含有0.5 M NaCl的培养基上的抑制率显著增加,而在含有400μg/mL荧光增白剂和0.5 M山梨醇的培养基上,无显著差异;在pH为4-10时,生长速率显著降低,而在pH为11-12时,无显著性差异;在苹果果实和苹果枝条上的病斑大小无显著性差异,回补菌株均恢复到野生型水平。表明基因VM1G_08720在病菌分生孢子器的产生、酸碱度的响应、维持细胞壁完整性以及渗透胁迫方面发挥重要作用。