黄连素通过诱导G_(0)/G_(1)或G_(2)/M期阻滞抑制前列腺癌细胞株PC-3的增殖作用分析

目的观察黄连素在体外对前列腺癌细胞株PC-3的抑制及凋亡的诱导,并进一步探讨其作用机制。方法采用MTT法检测不同浓度黄连素对前列腺癌细胞株PC-3的增殖抑制作用,采用流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡,通过PI染色法结合流式细胞仪检测黄连素对前列腺癌细胞株PC-3细胞周期的影响;蛋白免疫印迹(WB)方法检测黄连素作用于前列腺癌细胞株PC-3后细胞中脂肪酸合成酶(FAS)蛋白的表达。结果黄连素组前列腺癌PC-3细胞株增殖抑制率及凋亡率均高于未加入黄连素组,且随着黄连素浓度的上升,前列腺癌PC-3细胞株增殖抑制率及凋亡率均逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。黄连素孵育24 h组、黄连素孵育48 h组、黄连素孵育72 h组的前列腺癌PC-3细胞株在G_(0)/G_(1)期比例高于对照组,在S期与G_(2)/M期比例低于对照组,且随黄连素孵育时间增加,前列腺癌PC-3细胞株在G_(0)/G_(1)期比例明显增加,在S期与G_(2)/M期比例逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05)。黄连素不同孵育时间及不同浓度均对前列腺癌PC-3细胞株中FAS蛋白存在影响,且随着孵育时间的延长与浓度的增加,FAS蛋白含量均逐渐减少。结论黄连素可通过诱导细胞G_(2)/M期阻滞和抑制前列腺癌PC-3细胞株中FAS蛋白表达对前列腺癌细胞株PC-3的增殖生长及凋亡起到抑制与促进作用,且与时间、浓度呈依赖性。

棕矢车菊素诱导人宫颈癌Hela细胞G_(2)/M期停滞的机制研究

目的:研究棕矢车菊素对宫颈癌(cervical carcinoma,CC)细胞Hela的增殖抑制和周期阻滞能力,探索棕矢车菊素是否具有宫颈癌治疗药物的潜力。方法:MTT比色法检测细胞活力;羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl amino ester,CFSE)法检测细胞增殖水平变化;碘化丙啶(propidium,PI)单染检测细胞周期;免疫印迹法(western blot,WB)检测细胞蛋白表达水平。采用裸鼠成瘤检测棕矢车菊素体外抑制肿瘤效果。结果:棕矢车菊素可以显著抑制Hela细胞活力水平,且具有时间和浓度依赖性;棕矢车菊素抑制Hela细胞增殖,且100μmol/L棕矢车菊素可显著诱导细胞发生G_(2)/M周期阻滞。分子机制上,研究证明了棕矢车菊素可以通过促进细胞周期检验点激酶(checkpoint kinase 2,CHK2)激活,抑制细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cyclin 25 homolog C,CDC25C)活力,从而提高无活性的pCDC2水平。棕矢车菊素同时降低了Cyclin B1表达。因此,棕矢车菊素通过抑制G_(2)/M期调控蛋白Cyclin B1/CDC2复合物活性来诱导细胞发生G_(2)/M期阻滞。同时,体外裸鼠成瘤,棕矢车菊素灌胃4周后,小鼠肿瘤体积显著减小。结论:在Hela细胞上,棕矢车菊素具有抑制细胞增殖和诱导G_(2)/M期阻滞的作用,证明了棕矢车菊素具有抗宫颈癌细胞的治疗潜力。

莱菔硫烷诱导急性髓系白血病KG1a和KG1细胞G_(2)/M期阻滞的作用和相关机制

目的:研究莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)对急性髓系白血病细胞G_(2)/M期阻滞的作用和相关机制。方法:不同浓度的SFN作用KG1a和KG1细胞48 h后,流式细胞术检测细胞周期的变化,利用高通量转录组测序技术检测SFN对KG1a细胞周期相关基因表达情况的影响;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测P53、P21、CDC2、CyclinB1的mRNA表达。采用Western blot检测P53、CDC2、P-CDC2和CyclinB1的蛋白表达。结果:经SFN作用48 h后,KG1a和KG1细胞的G_(2)/M期细胞明显增多,当SFN浓度为8μmol/L时,KG1a细胞在G_(2)/M期从11.9%上升至54.0%,KG1细胞从18.5%上升至83.3%(P <0.001)。SFN作用KG1a细胞后,KEGG通路分析结果显示,差异表达基因显著富集P53信号通路。热图结果显示,P53和P21基因表达上调,CDC2基因表达下调。KG1a和KG1细胞经SFN作用后,p53和P21的mRNA水平均出现上调(P <0.05或P <0.01)。随着SFN剂量的上升,CDC2的mRNA水平呈下调趋势,当SFN为8μmol/L时,CDC2的mRNA表达水平显著低于对照组(P <0.05)。经SFN作用KG1a和KG1后,p53的蛋白水平出现上调,SFN 8和12μmol/L浓度组均高于对照组,差异有统计学意义(P <0.05)。两组细胞经SFN作用后CDC2的蛋白水平均明显下降,且呈浓度依赖趋势(r=0.9482和r=0.8977),SFN8和12μmol/L浓度组CDC2蛋白水平均明显低于对照组(P <0.05或P <0.01),P-CDC2蛋白表达水平上调。CyclinB1的蛋白和mRNA表达水平一致,变化不明显。结论:SFN可能通过激活P53信号通路,进一步抑制CDC2表达和CDC2/CyclinB1复合物的活性,诱导急性髓系白血病KG1a和KG1细胞阻滞在G_(2)/M期。

二烯丙基二硫通过磷酸化Chk1负调控Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路阻滞白血病K562细胞G_(2)/M期

目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病K562细胞周期阻滞及其分子机制。方法:采用CCK-8、细胞计数及流式细胞术观察DADS对K562细胞增殖与周期阻滞效应。Western Blot检测DADS对K562细胞PCNA、Chk1/2以及下游分子Cdc25C、CyclinB1与CDK1表达的影响。结果:CCK-8检测显示,15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L DADS处理后,呈浓度依赖性抑制K562细胞增殖,抑制率分别为32.48%、59.34%、66.42%、77.06%、81.05%(P<0.05)。对照组与Tween80组无抑制作用(P>0.05)。细胞计数结果显示,30μmol/L、60μmol/L与120μmol/L DADS处理K562细胞后,群体倍增时间分别为22.71±0.29、36.69±0.93与73.02±0.87呈浓度依赖性增加(P<0.05),而Tween80组与对照组无明显差异(P>0.05)。流式细胞术检测显示,60μmol/L与120μmol/L DADS作用K562细胞24 h与48 h后,G_(2)/M期百分率分别增加到17.6%与28.5%和18.6%与34.4%,较对照组有显著性差异(P<0.05)。60μmol/L DADS作用K562细胞1 h、2 h、4 h、8 h和24 h后,PCNA表达呈时间依赖性表达下调(P<0.05)。p-Chk1表达呈时间依赖性上调(P<0.05),而Chk1、Chk2与p-Chk2表达无明显差异(P>0.05)。并且,Cdc25C、CyclinB1和CDK1分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但是,14-3-3蛋白无明显改变(P>0.05)。结论:DADS可磷酸化Chk1通过Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路抑制K562细胞增殖与阻滞G_(2)/M期。

硼替佐米联合PLK1抑制剂处理肿瘤细胞A549、HeLa对其增殖影响

目的明确硼替佐米(bortezomib,PS341)和PLK1抑制剂处理肿瘤细胞HeLa、A549后细胞增殖的变化,探索不同药物组合使用的抗肿瘤作用机制。方法CCK-8法检测不同浓度分组的药物处理A549、HeLa细胞后的生长曲线;采用PI染色法检测PLK1抑制剂BI2536、GW843682X与蛋白酶体抑制剂PS341的合并使用对肿瘤细胞周期的影响;采用Western blot检测细胞周期相关蛋白和PLK1的蛋白表达水平。结果PLK1抑制剂BI2536、GW843682X均明显抑制A549、HeLa细胞生长并使其阻滞在G_(2)/M期,加入蛋白酶体抑制剂PS341后细胞增殖抑制被削弱、G_(2)/M期阻滞的细胞减少、周期蛋白cyclin E1异常积累。结论PS341可明显减弱PLK1抑制剂的细胞增殖抑制效果,认为PLK1抑制剂与PS341联合使用需考虑药效减弱的风险,推测相关分子机制涉及细胞周期蛋白代谢异常。

青蒿琥酯通过调控GADD45A、NACC1的表达抑制肝癌细胞的作用

目的阐明青蒿琥酯(artesunate,ART)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)病理进程中对肿瘤细胞的作用及潜在的机制。方法用含不同浓度ART的培养基处理两种HCC细胞系MHCC-97H、HCC-LM3,以0 mg·L-1 ART处理的细胞作为对照组,对比ART对HCC的作用。采用MTT和克隆形成实验测定ART对HCC细胞生长能力的影响;划痕实验和Transwell实验分别检测ART对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术验证ART对HCC细胞凋亡和细胞周期变化的影响;通过转录组测序分析以及qRT-PCR验证关键基因的表达情况探究ART在HCC细胞中的可能作用机制。结果与对照组相比,ART处理后的肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力明显降低(P<0.01),而细胞凋亡率明显上升,且G_(2)/M期细胞比例明显增高,提示肿瘤细胞被阻滞于该期。使用RNA测序数据进行转录组学分析,确定生长停滞与DNA损伤诱导蛋白45A(growth arrest and DNA damage inducible alpha,GADD45A)是ART的潜在作用靶点,并且提示,ART可通过上调GADD45A的表达进而诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。此外,生信分析结果提示,GADD45A与其上游转录因子伏隔核相关蛋白1(nucleus accumbens associated 1,NACC1)有蛋白互作现象,并且经ART处理后,GADD45A与NACC1的mRNA水平和蛋白水平均发生明显变化。结论ART可能通过影响GADD45A及其潜在上游NACC1基因的表达抑制HCC的发生发展。通过探究ART作用于HCC的功能影响及发生机制,为临床治疗肝癌提供新药物、新方向和新思路。