二烯丙基二硫通过磷酸化Chk1负调控Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路阻滞白血病K562细胞G_(2)/M期

目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病K562细胞周期阻滞及其分子机制。方法:采用CCK-8、细胞计数及流式细胞术观察DADS对K562细胞增殖与周期阻滞效应。Western Blot检测DADS对K562细胞PCNA、Chk1/2以及下游分子Cdc25C、CyclinB1与CDK1表达的影响。结果:CCK-8检测显示,15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L DADS处理后,呈浓度依赖性抑制K562细胞增殖,抑制率分别为32.48%、59.34%、66.42%、77.06%、81.05%(P<0.05)。对照组与Tween80组无抑制作用(P>0.05)。细胞计数结果显示,30μmol/L、60μmol/L与120μmol/L DADS处理K562细胞后,群体倍增时间分别为22.71±0.29、36.69±0.93与73.02±0.87呈浓度依赖性增加(P<0.05),而Tween80组与对照组无明显差异(P>0.05)。流式细胞术检测显示,60μmol/L与120μmol/L DADS作用K562细胞24 h与48 h后,G_(2)/M期百分率分别增加到17.6%与28.5%和18.6%与34.4%,较对照组有显著性差异(P<0.05)。60μmol/L DADS作用K562细胞1 h、2 h、4 h、8 h和24 h后,PCNA表达呈时间依赖性表达下调(P<0.05)。p-Chk1表达呈时间依赖性上调(P<0.05),而Chk1、Chk2与p-Chk2表达无明显差异(P>0.05)。并且,Cdc25C、CyclinB1和CDK1分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但是,14-3-3蛋白无明显改变(P>0.05)。结论:DADS可磷酸化Chk1通过Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路抑制K562细胞增殖与阻滞G_(2)/M期。

黄连素通过诱导G_(0)/G_(1)或G_(2)/M期阻滞抑制前列腺癌细胞株PC-3的增殖作用分析

目的观察黄连素在体外对前列腺癌细胞株PC-3的抑制及凋亡的诱导,并进一步探讨其作用机制。方法采用MTT法检测不同浓度黄连素对前列腺癌细胞株PC-3的增殖抑制作用,采用流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡,通过PI染色法结合流式细胞仪检测黄连素对前列腺癌细胞株PC-3细胞周期的影响;蛋白免疫印迹(WB)方法检测黄连素作用于前列腺癌细胞株PC-3后细胞中脂肪酸合成酶(FAS)蛋白的表达。结果黄连素组前列腺癌PC-3细胞株增殖抑制率及凋亡率均高于未加入黄连素组,且随着黄连素浓度的上升,前列腺癌PC-3细胞株增殖抑制率及凋亡率均逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。黄连素孵育24 h组、黄连素孵育48 h组、黄连素孵育72 h组的前列腺癌PC-3细胞株在G_(0)/G_(1)期比例高于对照组,在S期与G_(2)/M期比例低于对照组,且随黄连素孵育时间增加,前列腺癌PC-3细胞株在G_(0)/G_(1)期比例明显增加,在S期与G_(2)/M期比例逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05)。黄连素不同孵育时间及不同浓度均对前列腺癌PC-3细胞株中FAS蛋白存在影响,且随着孵育时间的延长与浓度的增加,FAS蛋白含量均逐渐减少。结论黄连素可通过诱导细胞G_(2)/M期阻滞和抑制前列腺癌PC-3细胞株中FAS蛋白表达对前列腺癌细胞株PC-3的增殖生长及凋亡起到抑制与促进作用,且与时间、浓度呈依赖性。

HPLC法测定小儿扶脾颗粒中黄曲霉毒素B_1、B_2、G_1、G_2含量

目的:建立高效液相色谱法测定小儿扶脾颗粒中黄曲霉毒素B_1、B_2、G_1、G_2的含量,并通过对31批样品检测结果的分析初步研究小儿扶脾颗粒在黄曲霉毒素污染方面的安全性,以提示企业选择安全的原料药材投料。方法:采用柱后光化学衍生HPLC法测定小儿扶脾颗粒中黄曲霉毒素的含量。采用Ecosil C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-水(30∶10∶60),荧光检测器,激发波长为360 nm,发射波长为450 nm,流速为0.8 ml·min^(-1),柱温为30℃进样量为20μl。结果:黄曲霉毒素B_1、B_2、G_1、G_2分别在9.65~48.25 pg(r=0.999 1)、2.45~12.25 pg(r=0.999 8)、10.5~52.5 pg(r=0.995 6)、2.55~12.75 pg(r=0.996 6)范围内线性关系良好;加样回收率在83.3%~95.6%之间。有14批样品检出黄曲霉毒素,其总含量为0.21×10^(-3)~0.54×10^(-3)μg·g^(-1)。结论:该方法操作简便,结果稳定可靠,可用于小儿扶脾颗粒的质量控制。

HPLC-MS/MS法测定化妆品中黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)、B_(1)

建立高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定化妆品中黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)、B_(1)的方法。化妆品经70%甲醇提取并经免疫亲和柱净化,采用C_(18)柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm),流动相体系为2.0 mmol/L乙酸铵甲醇溶液(含0.1%甲酸)和2.0 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸),流速为0.3 mL/min进行梯度洗脱,扫描方式为正离子多反应监测模式(MRM)。黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)、B_(1)在一定浓度范围内线性关系均良好,相关系数不低于0.998。检出限范围为0.028~0.078 ng/g。精密度及稳定性均良好,回收率85.0%~96.2%。该方法准确、高效,为化妆品中黄曲霉毒素的测定提供了技术支持。

启脾丸中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)含量测定及安全性评价

目的建立高效液相色谱法测定启脾丸中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的含量,并评价启脾丸中黄曲霉毒素安全性。方法样品提取后通过免疫亲和柱处理,采用HPLC-柱后衍生-FLD法对全国10个生产企业的64批启脾丸进行测定。结果启脾丸中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的平均回收率为84.09%、84.38%、83.11%、86.33%,RSD为2.5%、2.0%、2.8%、1.9%,64批启脾丸中52批检出黄曲霉毒素,检出率为81.2%,不合格率为9.4%,部分样品存在黄曲霉毒素污染的问题。结论该方法操作简便,结果稳定可靠,可为该制剂的质量安全控制提供依据。

UPLC-MS/MS测定健脾丸中的黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)和B_(1)

建立了超高效液相色谱串联四级杆质谱法(UPLC-MS/MS)测定健脾丸(大蜜丸和小蜜丸)中黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)和B_(1)的含量的方法。样品经75%的甲醇提取和免疫亲和柱净化后,以超高效液相色谱串联四级杆质谱进行分析测定。黄曲霉毒素G_(2)、G_(1)、B_(2)和B_(1)分别在0.0304~3.040 ng/mL(r=0.9998)、0.0848~8.480(r=0.9996)、0.0344~3.440(r=0.9996)、0.0816~8.160(r=0.9996)范围内线性关系良好;加样回收率在86.6%~91.7%之间。12批样品检出黄曲霉毒素。该法灵敏、快速、准确,专属性强,可用于测定健脾丸(大蜜丸和小蜜丸)中黄曲霉毒素。

青蒿琥酯通过调控GADD45A、NACC1的表达抑制肝癌细胞的作用

目的阐明青蒿琥酯(artesunate,ART)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)病理进程中对肿瘤细胞的作用及潜在的机制。方法用含不同浓度ART的培养基处理两种HCC细胞系MHCC-97H、HCC-LM3,以0 mg·L-1 ART处理的细胞作为对照组,对比ART对HCC的作用。采用MTT和克隆形成实验测定ART对HCC细胞生长能力的影响;划痕实验和Transwell实验分别检测ART对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术验证ART对HCC细胞凋亡和细胞周期变化的影响;通过转录组测序分析以及qRT-PCR验证关键基因的表达情况探究ART在HCC细胞中的可能作用机制。结果与对照组相比,ART处理后的肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力明显降低(P<0.01),而细胞凋亡率明显上升,且G_(2)/M期细胞比例明显增高,提示肿瘤细胞被阻滞于该期。使用RNA测序数据进行转录组学分析,确定生长停滞与DNA损伤诱导蛋白45A(growth arrest and DNA damage inducible alpha,GADD45A)是ART的潜在作用靶点,并且提示,ART可通过上调GADD45A的表达进而诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。此外,生信分析结果提示,GADD45A与其上游转录因子伏隔核相关蛋白1(nucleus accumbens associated 1,NACC1)有蛋白互作现象,并且经ART处理后,GADD45A与NACC1的mRNA水平和蛋白水平均发生明显变化。结论ART可能通过影响GADD45A及其潜在上游NACC1基因的表达抑制HCC的发生发展。通过探究ART作用于HCC的功能影响及发生机制,为临床治疗肝癌提供新药物、新方向和新思路。

DNA吸附消除黄曲霉毒素G_(1)

鉴于黄曲霉毒素G1(AFG_(1))的毒性强,难降解和有效去除,利用AFG_(1)与DNA的嵌插结合,构建选择性吸附消除AFG_(1)的有效方法。AFG_(1)嵌入DNA的最佳反应条件为pH 7.4及30℃,其DNA结合饱和值和去除率为1.66、88.14%。添加NaCl、CaCl_(2)、L-天冬氨酸、葡萄糖、尿素、亮氨酸、赖氨酸、维生素C等后,DNA结合饱和值分别为1.45、1.45、1.29、1.05、1.95、1.95、2.32和2.90。去除率分别为78.08%、76.44%、75.92%、75.16%、88.41%、88.67%、88.87%、90.27%。NaCl、CaCl_(2)、L-天冬氨酸、葡萄糖等负电基团或者离子强度较高不利于AFG_(1)-DNA嵌插结合,而尿素、亮氨酸、赖氨酸、维生素C等带正电基团和相似基团的物质利于AFG_(1)-DNA的嵌插结合。花生油中的AFG_(1)的去除率达到80%以上。动力学相关系数和吸附容量可知,该吸附过程符合准二级动力学模型,表明吸附过程的限速步骤为化学相互作用。吸附过程遵循Freundlich等温吸附模型,该吸附过程为多层吸附。热力学结果显示DNA对AFG_(1)的吸附是自发的放热过程。综上,DNA能选择性吸附AFG_(1),因此,可进一步开发DNA新型材料,在去除食品中黄曲霉毒素方面有重要意义。

GTSE1在肝癌中的表达及其对预后和免疫浸润的影响

目的研究G_(2)/S期应答相关蛋白1(G_(2) and S phase-expressed protein 1,GTSE1)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达、免疫学作用和预后分析,及其潜在作用机制。方法使用公共数据库癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)提供的数据,用Kaplan-Meier、肿瘤免疫评估资源(Tumor Immune Estimation Resource,TIMER)数据库和基因表达谱交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)数据库进行GTSE1基因表达、免疫学作用及预后分析,通过免疫组化实验验证GTSE1在临床样本中的表达,应用R软件对GTSE1相关差异基因进行基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。结果GTSE1在人类癌组织中显著高表达,且与肝细胞癌预后不良显著相关(P<0.05);GTSE1基因表达与HCC中浸润性免疫细胞的丰度显著相关(P<0.001)。GTSE1相关的差异表达基因主要富集于核分裂、细胞器裂变、离子通道活性等基因模块;其参与的信号通路主要包括神经活性配体-受体的相互作用、细胞周期等。结论GTSE1在HCC中的表达显著上调并与患者预后不良显著相关,且在免疫细胞浸润中发挥重要作用,可作为HCC的预后标志物和免疫治疗靶点。

Chk1在K562/A02细胞耐药中的作用机制

目的研究检测点激酶1(Chk1)对K562/A02细胞周期及凋亡的影响,探讨Chk1在肿瘤细胞耐药中的作用机制。方法以人红白血病细胞系K562及其耐药细胞株K562/A02为研究对象,与阿霉素共同孵育后,RT-PCR检测Chk1mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白质的表达及磷酸化水平,MTT法检测药物敏感性,流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡。结果Chk1 mRNA及蛋白表达水平在两种细胞间无显著差异(均P>0.05);Chk1磷酸化水平在K562/A02细胞为(0.79±0.56),K562细胞为(0.27±1.47),其差异有显著性意义(P<0.05)。阿霉素作用6h后,致K562/A02细胞阻滞在G2/M期的细胞百分率为(54.12±0.57)%,显著高于K562细胞的(36.99±1.28)%(P<0.05),K562/A02细胞凋亡率为(6.25±0.81)%,显著低于K562细胞的(66.47±1.26)%(P<0.05)。阿霉素对K562/A02和K562细胞的IC50值分别为(109.65±0.26)mg/L、(1.08±0.74)mg/L,耐药倍数为102倍。结论由于G2/M期阻滞是导致白血病细胞耐药的机制之一,Chk1磷酸化水平与G2/M期阻滞和细胞凋亡密切相关,提示Chk1的活化状态可能参与K562/A02细胞的耐药机制。

硼替佐米联合PLK1抑制剂处理肿瘤细胞A549、HeLa对其增殖影响

目的明确硼替佐米(bortezomib,PS341)和PLK1抑制剂处理肿瘤细胞HeLa、A549后细胞增殖的变化,探索不同药物组合使用的抗肿瘤作用机制。方法CCK-8法检测不同浓度分组的药物处理A549、HeLa细胞后的生长曲线;采用PI染色法检测PLK1抑制剂BI2536、GW843682X与蛋白酶体抑制剂PS341的合并使用对肿瘤细胞周期的影响;采用Western blot检测细胞周期相关蛋白和PLK1的蛋白表达水平。结果PLK1抑制剂BI2536、GW843682X均明显抑制A549、HeLa细胞生长并使其阻滞在G_(2)/M期,加入蛋白酶体抑制剂PS341后细胞增殖抑制被削弱、G_(2)/M期阻滞的细胞减少、周期蛋白cyclin E1异常积累。结论PS341可明显减弱PLK1抑制剂的细胞增殖抑制效果,认为PLK1抑制剂与PS341联合使用需考虑药效减弱的风险,推测相关分子机制涉及细胞周期蛋白代谢异常。

外周血单个核细胞GTSE1水平与上皮性卵巢癌预后的相关性

目的:探究外周血单个核细胞G_(2)/S期应答相关蛋白1(G_(2)and S phase-expressed-1,GTSE1)水平与上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)预后的关系。方法:GEPIA和Kaplan-Meier Plotter分析GTSE1在卵巢癌组织中的表达及其与预后的关系。选择2017年04月至2020年10月本院126例EOC患者(EOC组)和40例同期无EOC的健康体检者(对照组)作为研究对象。Ficoll密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞,蛋白质免疫印迹法检测GTSE1水平。Spearman相关分析EOC组织和外周血单个核细胞中GTSE1水平的关系。随访了解EOC预后,用COX回归分析EOC预后的风险因素。结果:GEPIA和Kaplan-Meier Plotter分析结果显示,卵巢癌组织中GTSE1水平高于正常卵巢组织(P<0.05),GTSE1低水平卵巢癌患者的中位无进展生存时间高于GTSE1高水平卵巢癌患者(P<0.05)。随访期间复发98例(77.8%),其中铂类敏感型65例,铂类耐药型33例;死亡41例(32.5%)。EOC组的外周血单个核细胞中GTSE1 mRNA和GTSE1蛋白水平均高于对照组(P<0.001)。EOC患者癌组织和外周血单个核细胞中GTSE1水平呈正相关关系(r_(s)=0.225,P=0.011)。国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)Ⅰ-Ⅱ期患者的GTSE1水平低于Ⅲ-Ⅳ期的患者(P<0.001);未复发患者的GTSE1水平低于铂类敏感型和铂类耐药型的患者(P<0.05);生存患者的GTSE1水平低于死亡患者(P<0.001)。GTSE1高水平患者的无复发生存时间和总生存时间均低于GTSE1低水平患者(P<0.001)。COX回归分析结果显示,FIGO分期高(HR=2.110,95%CI:1.465~3.038,P<0.001;HR=2.261,95%CI:1.212~4.216,P=0.011)、初次手术残存灶>1 cm(HR=1.724,95%CI:1.130~2.631,P=0.012;HR=2.465,95%CI:1.246~4.874,P=0.010)和GTSE1>1.29(HR=2.071,95%CI:1.304~3.291,P=0.002;HR=5.634,95%CI:2.410~13.169,P<0.001)是EOC预后(复发和生存)的独立危险因素,应用贝伐单抗(HR=0.293,95%CI:0.116~0.738,P=0.010;HR=0.141,95%CI:0.056~0.357,P<0.001)是EOC预后的独立保护因素。结论:EOC患者外周血单个核细胞中GTSE1水平高提示预后不良风险高。

超高效液相色谱-串联质谱法测定坚果中的黄曲霉毒素含量

开心果、核桃、杏仁是深受人们喜爱的坚果,对人类健康有诸多益处,还是一种极好的营养来源。同时,此类坚果还与化学危害有关,发霉变质产生的真菌毒素时刻威胁着人们健康。为建立快捷、准确、高效的开心果、核桃和杏仁中黄曲霉毒素B_(1),B_(2),G_(1),G_(2)超高效液相色谱-串联质谱测定方法。样品以乙腈水提取,通过优化的QuEChERS净化,过MycoSep226多功能净化柱富集,超高效液相色谱质谱联用仪测定。在0.5~5.0 g/kg添加水平下回收率为85.9%~112.4%;相对偏差(RSD)在1.02%~5.75%,黄曲霉B_(1),B_(2),G_(1),G_(2)方法定量限为0.5 g/kg。结果表明,该方法快速便捷、回收率稳定,适用于开心果、核桃和杏仁中黄曲霉毒素B_(1),B_(2),G_(1),G_(2)的定量测定。

HPLC柱后光化学衍生荧光检测法检测3种含土鳖虫中成药的黄曲霉毒素

目的:考察免疫亲和净化HPLC柱后光化学衍生荧光检测法在中成药中黄曲霉毒素测定的可行性,并对其污染情况进行筛查,为中成药黄曲霉毒素污染监管提供依据。方法:采用免疫亲和净化HPLC柱后光化学衍生荧光检测法对含有土鳖虫的中成药中黄曲霉毒素的含量进行测定。样品经有机溶剂提取、免疫亲和柱净化后,利用高效液相色谱-光化学衍生-荧光检测器进行分析测定。对3种含土鳖虫的中成药,考察加样回收率,测定黄曲霉毒素残留量,并对测定结果进行分析。采用高效液相色谱-串联质谱法对部分超出限度批次进行结果确认。结果:3种中成药中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的回收率均在80%~113%。3种24批中成药中,21批检出黄曲霉毒素,检出率为87.5%,部分批次黄曲霉毒素含量明显偏高。结论:免疫亲和净化HPLC柱后光衍生荧光检测法结果准确,重现性好,可用于中成药中黄曲霉毒素的测定。含土鳖虫药材的中成药,个别品种黄曲霉毒素污染情况较为严重,存在安全隐患,应引起生产企业的重视,保障用药安全。

柱后碘衍生法荧光检测黄曲霉毒素的方法探讨

目的优化柱后碘衍生法检测中药材中黄曲霉毒素G_2,G_1,B_2,B_1的含量。方法样品经甲醇-水(70:30)提取后,通过免疫亲和柱净化、柱后碘衍生高效液相色谱-荧光检测器测定。结果在优化条件下,黄曲霉毒素G_2、G_1、B_2、B_1的检出限分别为0.20,0.05,0.15,0.02μg/kg,回收率分别为78.63%,81.75%,79.47%,80.70%。结论该方法简便快速,灵敏度高,重复性好,可满足中药材中黄曲霉毒素含量检测的需要。

多功能净化柱-柱前衍生-高效液相色谱法测定菜籽油中4种黄曲霉毒素

本文研究建立一种多功能净化柱-高效液相色谱法测定菜籽油中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)含量的方法。试样经PriboFast^(■)多功能净化柱净化,三氟乙酸柱前衍生后采用高效液相色谱法测定,以保留时间定性,外标法定量。结果表明,四种黄曲霉毒素在0.03~40.0μg/L线性范围内关系良好,相关系数(r^(2))均大于0.998,检测限均为0.03μg/kg,定量限均为0.1μg/kg,当添加浓度为0.1和0.5μg/kg,回收率为79.6%~89.0%,测定结果RSD(n=6)在0.8%~2.4%之间。