麦类粮食3种检疫性病原真菌三重荧光PCR检测方法的建立

麦类壳多胞斑点病菌(Parastagonospora pseudonodorum)、小麦基腐病菌(Oculimacula yallundae)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)是麦类作物上的重要检疫性病原真菌。建立一种可以同时检测上述3种植物病原真菌的三重荧光PCR方法,可以实现进境麦类粮食中这3种病原真菌的快速准确检疫鉴定。在对麦类壳多胞斑点病菌TUB2基因、小麦基腐病菌ITS1基因、小麦全蚀病菌EF1-α基因单重荧光PCR扩增引物与探针浓度优化的基础上,对三重荧光PCR扩增的引物与探针浓度进行优化,据此进一步对三重荧光PCR扩增程序的退火温度进行优化,建立了可同时检测上述3种植物病原真菌的三重荧光PCR方法,并对该方法的特异性和灵敏度分别进行了验证。结果表明:三重荧光PCR扩增时,TUB2基因、ITS1基因、EF1-α基因的引物与探针最优添加量分别为0.5、0.6和0.6μL,最优退火温度为60℃。特异性验证结果显示,3种靶标菌株均出现了显著扩增;而10株非靶标菌株均未出现扩增,结果为阴性。灵敏度验证结果显示,3种靶标病菌的检测灵敏度分别为41、39、45 fg/μL。本研究建立的三重实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高,能够同时快速准确鉴定麦类壳多胞斑点病菌、小麦基腐病菌、小麦全蚀病菌,适用于口岸进境粮食这3种病原真菌的快速准确鉴定。