重组HIV-1 Gag/Env融合抗原在大肠杆菌中的表达及免疫学分析

在大肠杆菌中， 利用ｐＤＯＧ 载体来源的表达载体ｐＤＧａｇＥｎｖ ， 高效表达了相对分子质量（ Ｍｒ） 为４６ ５００（ｐ４６） 的重组ＨＩＶ１Ｇａｇ／ Ｅｎｖ 融合抗原（Ｇａｇ２０９ ～４３７ ＋ Ｅｎｖ４７４ ～５１８ ＋ Ｅｎｖ５４８ ～６７５） 。表达产物同时还包括：Ｍｒ ～２８ ５００ ， Ｍｒ ～２２ ０００ 与 Ｍｒ ～１９ ０００ ３ 种（ｐ２８ ，ｐ２２ 和ｐ１９） 蛋白。此４ 种表达产物均存在于包涵体中，不能被８ ｍ ｏｌ／Ｌ 尿素溶解。Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹分析表明，４ 种重组蛋白均能与ＨＩＶ１ 阳性血清发生特异反应；其中ｐ４６ 与ｐ２８ 蛋白能与抗ＨＩＶ１ｐ２４ 反应，而ｐ２２ 与ｐ１９ 蛋白则不与其起反应。其中ｐ１９ 蛋白对应于Ｅｎｖ４８２ ～５１８ ＋ Ｅｎｖ５４５ ～６７５ ，ｐ２２ 蛋白可能是从Ｇａｇ／ Ｅｎｖ 表达质粒的ｇａｇ 基因内部的甲硫氨酸（ＡＴＧ４２３） 起始的翻译产物。将包涵体充分洗涤后，利用制备电泳方法纯化了ｐ４６ ，ｐ２２／ｐ１９ 及ｐ１９ 蛋白。将后两种纯化蛋白质以２ ｍ ｇ／Ｌ 的浓度包被ＥＬＩＳＡ 板，检测了国家卫生部药品生物制品检定所提供的ＨＩＶ１／ ＨＩＶ２ 质检血清。结果可检出其中包含的所有１８ 份ＨＩＶ?

HIV-1 gag和env基因片段的构建及表达

为研究人免疫缺陷病毒（HIV－1）的分子生物学，发展艾滋病的诊断试剂，克隆了含HIV－1env和gag基因cDNA的质粒pUCF12。用PvuⅡ和HincⅡ降解pUCF12质粒，得到含部分p17、全部p24和全部p15基因的cDNA片段，用BglⅡ降解pUCF12质粒得到含有部分gp120和全部gp41的cDNA片段。将该两个片段分别亚克隆到表达载体PGex上，在pTac启动子的调控下，部分gag基因和env基因在大肠杆菌中表达．在SDS－PAGE中，GST＋gag融合蛋白呈现一条约70kD的染色带，其表达水平约占菌体总蛋白的18％．而GST－env蛋白则呈现一条约65kD的蛋白带，该表达蛋白约占菌体总蛋白的15％。经免疫印迹分析，该两种表达产物可分别与抗-P24和抗-gP41的单克隆抗体反应，用Abbott试剂也证明为HIV－1抗原蛋白。

Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中国流行株B亚型Gag和Env蛋白在大肠杆菌中的表达

将中国流行株 型人免疫缺陷病毒 ( HIV-1 ) B亚型 gag基因和 env基因定向插入原核表达载体p ET2 8a和 p ET2 8c,获得重组表达质粒 p ETG、p ETM1、p ETM2和 p ETM3。将 p ETG转化表达宿主菌 BL2 1( DE3 ) plys S,用 IPTG诱导 ,SDS-PAGE电泳分析有重组蛋白表达。该蛋白表达量随诱导时间的延长而逐渐增加 ,4 h达到最大值。凝胶扫描结果显示 ,该蛋白表达量占菌体总蛋白的 1 0 .3 %。Western blotting检测 ,该重组蛋白可与中国流行株 HIV-1 B亚型阳性血清发生特异反应。重组表达质粒 p ETM1、p ETM2和 p ETM3仅在蛋白印迹中与 gp1 2 0单抗发生特异性反应而出现特异显色带 ,SDS-PAGE电泳分析未见表达蛋白带。

人Ⅰ型免疫缺陷病毒gag-env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Gag和Env蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒 (Humanimmunodeficiencyvirustype 1,HIV 1)的结构蛋白 ,是HIV 1诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多次亚克隆 ,将env基因以正确的三联密码读框插入 gag基因的下游 ,制备了HIV 1gag env嵌合基因 ,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒 p7 5启动子和牛痘病毒A型包涵体 (ATI)启动子的下游 ,经过同源重组和红细胞吸附试验筛选 ,获得了 2株重组痘苗病毒。免疫荧光试验和酶免疫试验证明 ,两株重组痘苗病毒均能正确地表达HIV 1gag env嵌合基因。动物实验表明 ,gag env嵌合基因重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗HIV特异性抗体。这些结果为艾滋病颗粒化疫苗的研制提供了借鉴。

HIV-1env、gag与IFNα-2b基因融合蛋白的免疫学研究

目的将编码艾滋病病毒(HI V-1)外膜蛋白的env基因、核蛋白的gag基因与编码干扰素(IFNα-2b)基因分别插入pSFJ16与pSFJ38真核表达载体,观察表达产物诱导机体产生细胞免疫的变化规律。方法利用分子生物学技术构建重组质粒,经质脂体转染与野生型痘苗病毒在Cos-7细胞内同源重组,筛选、纯化获得重组痘苗病毒vJ38gag/IFNα-2b和vJ16env/IFNα-2b。免疫小鼠后,检测小鼠外周血与脾淋巴细胞对ConA及Lps的反应性,用流式细胞仪测定小鼠脾细胞CD4+、CD8+,细胞计数。结果外周血与脾淋巴细胞对ConA及Lps的反应性,实验组与对照组比较有显著差异(P<0.05)。CD4+T淋巴细胞与对照组比较有显著差异(P<0.05)。CD8+T淋巴细胞与对照组比较无显著差异(P>0.05),但呈增高趋势。结论重组痘苗病毒能诱导小鼠产生较强的细胞免疫。重组痘苗病毒能在体外与HI V-1env和HI V-1gag阳性血清发生特异性反应,具有免疫原性和免疫反应性。

人泡沫病毒GAG、ENV蛋白的原核表达、抗血清制备及鉴定

构建了HFV的GAG和ENV蛋白原核表达载体pET-32a-gag和pET-32a-env,转化E.coli BL21Star(DE3)后用IPTG诱导出高水平的GAG、ENV融合蛋白表达.以融合蛋白免疫新西兰兔制备了GAG和ENV抗血清.Western Blot检测表明,抗血清可以识别原核表达的GAG和ENV蛋白,说明抗血清具有较好的特异性.结合Western Blot和间接免疫荧光实验,表明抗血清可以检测到病毒表达的GAG和ENV蛋白.

一株猫艾滋病病毒的巢式PCR检测及亚型鉴定

为了进一步了解猫免疫缺陷病毒(FIV)的区域流行情况,试验采用巢式PCR方法对15份流浪猫全血样品进行FIV gag基因扩增,检测出FIV阳性样品后再通过巢式PCR扩增得到FIV env基因V3~V5高变区序列,应用DNAMAN软件对阳性样品env基因的V3~V5高变区序列与NCBI中收录的参考毒株进行比对,使用MEGA 7.0软件构建进化树并进行遗传进化分析。结果表明:检测出1份FIV阳性样品,将FIV阳性株命名为XM07毒株,该毒株的env基因V3~V5高变区序列与NCBI中C78毒株的核苷酸序列相似性达到97.57%,与SH-2363毒株的核苷酸序列相似性达到96.83%;XM07毒株与SH-2363毒株在同一进化分支中,鉴定为A亚型。说明试验鉴定的FIV毒株未发生明显变异。

河北省2008年HIV-1感染者分子流行病学研究

目的利用分子生物学方法,了解2008年河北省新发现的感染者艾滋病病毒1型(HIV-1)毒株基因亚型的分布和变异情况。方法采集2008年河北省检测新发现的HIV-1感染者血样,提取血浆病毒RNA,使用套式聚合酶链反应对gag基因区和env基因区进行扩增并测定其序列。结果采集血样64份,扩增后获得序列共56份,共存在5种亚型。河北省HIV-1流行株主要为B亚型毒株,占43.1%(25/64);其次是CRF01-AE和CRF07-BC亚型毒株,各占25.9%(15/64)。结论河北省发现了5种HIV-1亚型毒株,B亚型毒株是主要的流行株,CRF01-AE亚型毒株所占比例较以往(2007年)有所下降。CRF-BC亚型毒株所占比例明显上升。可见,随着HIV-1流行时间的推移和传播途径的多样化,HIV-1流行的亚型比例也在发生变化。

克拉玛依市HIV-1 env gag pol基因特征变异研究

目的研究克拉玛依市HIV-1 env、gag、pol基因特征及不同亚型混合感染情况。方法巢氏PCR方法扩增2017年克拉玛依市HIV新发现病例env、gag、pol基因,结合已知亚型利用Mega软件分析测序结果。结果48份样本env、gag、pol三种基因分别获得合格序列36份、35份和41份,CRF07_BC是三种基因分型的主要亚型,CRF01_AE排第二位。除此外还发现克拉玛依市存在其他亚型和重组型,HIV-1 pol基因有新型变异亚型CRF79-0107、URF-01B、URF-02B。有6份样本存在三种基因分型不完全一致情况,即不同亚型混合感染。结论克拉玛依市HIV-1防控形势相对于新疆其他地市更加严峻,预防和控制艾滋病在不同人群间相互传播、防止混合感染为目前首要任务。

马传贫病毒主要基因变异研究进展

马传贫病毒是反转录病毒科慢病毒属的成员之一,它在体内要通过反转录酶的作用合成 DNA,整合到宿主的基因组中进行复制,由于反转录酶没有校正功能,使病毒在体内复制过程中 错误拷贝RNA基因组,导致高频率的遗传变异。近年国内外学者对EIAV的研究发现变异的基 因主要集中在env、gag、LTR和S2等区域,这些区域基因的变异与病毒的毒力、病毒在体内的复制 水平及免疫原性密切相关。由于EIAV是慢病毒中最简单的病毒,它具有独特的发病进程和明显 的病程分界,使其成为研究包括HIV 内其它慢病毒基因变异与临床症状之间相互关系的理想 动物模型。因此对EIAV基因变异情况的研究具有重要意义。

HIV-1 Gag和Env蛋白特异性ADCC反应与AIDS病程进展的关系

目的了解艾滋病病毒I型(HIV-1)Gag和Env蛋白特异性抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)反应,与艾滋病(AIDS)疾病进展的相关性。方法采集58份未经抗病毒治疗的、感染时间1年以内的男男性行为人群(MSM)标本,利用HIV-1特异性肽库刺激和流式细胞染色技术进行ADCC检测。结果病毒载量与HIV-1Gag特异性CD+2IFN-γ+细胞占CD-3细胞的比例呈显著的正相关(r=0.2919,P=0.0339);而01_AE亚型感染者的病毒载量与HIV-1Env特异性CD+2CD107a+细胞占CD-3细胞的比例呈显著负相关(r=-0.3454,P=0.0454)。结论在HIV-1感染早期,感染者体内可以产生Gag蛋白特异性的ADCC反应,其中Env蛋白特异性的ADCC反应具有控制疾病进展的作用。

内蒙古地区绵羊梅迪-维斯纳病毒全基因组序列的测定与分析

为了解内蒙古地区绵羊梅迪-维斯纳病毒(MVV)的分子结构特征和遗传变异情况,本研究利用Illumina Hiseq 4000二代测序技术对MVV阳性绵羊病肺组织进行病毒全基因组测定,并对全基因组特征、gag和env及其编码的氨基酸序列进行系统进化分析。结果显示,获得全长9193 bp的MVV全基因组序列,命名为NM1111,并上传GenBank获得基因登录号MW248464;全基因组、gag和env核苷酸序列与参考株的相应核苷酸序列的同源性分别为75.8%~81.4%、77.1%~86.8%和67.7%~75.5%;基于gag序列的系统进化分析,NM1111与A2型MVV聚为一支,属于A2型;Gag蛋白的主要同源区(MHR)存在D^(296)E的突变,Env蛋白变异程度较大,表面蛋白V4区存在氨基酸插入,SU5抗原表位在氨基端有一个完全保守的基序(VRAYTYGV),在羧基端有一个高度可变的基序。本研究提供了中国地区首个绵羊MVV完整序列,为中国地区MVV分子生物学特性研究提供基础参考。

山羊鼻内肿瘤病毒广东株的全基因测序与遗传进化分析

为了解山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的基因组特征和遗传变异情况,通过RT-PCR及序列分析方法从广东省某羊场送检病羊组织中鉴定出一株ENTV-2,将其命名为GDZJ2022。全基因组测序结果分析显示,GDZJ2022与GenBank中26株ENTV参考毒株核苷酸序列相似性为86.5%~96.9%,其中与四川ENTV-2-CHN3毒株序列同源性最高(96.9%),并处于同一分支。env核苷酸序列分析结果显示,GDZJ2022与四川株ENTV-2-CHN1同源性最高(98.6%);gag核苷酸序列分析结果显示,GDZJ2022与GDQY-2017同源性最高(95.2%)。

低水平病毒载量长期不进展人类免疫缺陷病毒-1感染者的人类免疫缺陷病毒-1的遗传分析

目的分析低水平病毒载量长期不进展（LTNP）HIV1感染者HIV-1的遗传特征。方法采用有限稀释套式PCR、终点PCR和序列确证分析等技术对5例低病毒载量LTNPHIV1感染者不同随访时间点H1V1前病毒enu基因c2-v3c3区域和gag基因p17区域进行扩增和序列分析，分别计算不同时间点内以及不同时间点与用于分析的最早时间点之间上述两个基因区域的基因多样性和基因离散率，依据基因离散率计算基因的进化率，统计学分析用GraphPadPrism5软件。结果5例患者在21个随访时间点共获得n5条c2-v3-c3序列和173条p17序列。进化树分析表明，不同患者的序列分开，同一患者的序列特异地聚集，序列质量可靠。5例患者env基因c2-v3-c3区域不同时间点基因多样性为0～6．38％，平均为2．1％，病例1、3和5基因多样性随感染时间的增加逐渐升高（r=0．7957、0．4954、0．3288），病例2和4基因多样性随感染时间的增加逐渐下降（r=-0．3759、-0．5028）；基因离散率为0．1％～6．5％，平均为2．9％，除病例1外，基因离散率均随感染时间间隔的增加逐渐升高，进化率分别为每年每位点-0．13％、0．81％、0．09％、0．14％和0．16％，平均为0．21％。gag基因p17区域基因多样性为0～2．5％，平均为1．2％，基因离散率为0．2％～2．7％，平均为1．4％，除病例3基因多样性和基因离散率随感染时间或时间间隔的增加下降外，其余病例均随感染时间或时间间隔的增加而逐渐升高，进化率分别为每年每位点0．087％、0．064％、-0．014％、0．081％和0．087％，平均为0．061％。结论低水平病毒载量LTNPHIV-1感染者H1V1有复制能力，病毒基因维持较低水平的进化；HIV-1-u基因变化的程度大于gag基因。

夫妻感染HIV-1病毒的分子流行病学研究

目的研究宁波市HIV-1感染夫妻的免疫状况和HIV毒株的亚型分布特点和流行规律。方法收集宁波市7对已经被确认为HIV-1型阳性夫妻的全血样品,对CD4+T淋巴细胞进行绝对计数,运用巢式PCR方法扩增病毒膜蛋白env基因和gag基因区并进行序列测定。应用DNASTAR软件对序列和参考序列进行比对分析,确定基因亚型。结果成功获得11条env基因序列和13条gag基因序列,确定6株为B’亚型,2株为01_AE流行重组型,2株为07_BC流行重组型,4株为08_BC流行重组型。该11例HIV-1阳性全血的CD4+T淋巴细胞绝对数最低7个/μl,最高654个/μl,平均288个/μl。结论宁波市夫妻感染HIV-1毒株存在多种亚型,大多数的感染者免疫状况低下需要抗病毒治疗,流行形势严峻,应加强对该人群免疫状况和HIV-1毒株亚型变异的监测,及时调整防治策略。

1例早期HIV感染者体内病毒准种的各基因片段分析

目的比较1例早期艾滋病病毒(HIV)感染者体内病毒不同基因片段准种复杂度。方法使用套式聚合酶链反应(Nested-PCR),扩增HIV感染者外周血淋巴细胞中病毒的gag、pol、vif-vpr和env区的部分基因,通过克隆、测序方法观察该感染者体内病毒准种分布情况,比较不同基因片段检测病毒准种的可靠性。结果不同基因片段检测病毒准种结果显示,该早期感染者体内的病毒不同基因片段显示的准种基因离散率不同,其中gag区显示出的病毒准种复杂度最高,反映为该区段病毒准种的基因离散率最高,为0·008;其他各区基因(pol、vif-vpr、env)的离散率依次为0·006、0·001、0·000。结论该HIV感染者体内病毒准种的基因中,gag区基因的突变率较高,提示Gag在机体感染HIV早期承受的免疫压力较高,因此在病毒准种研究中,gag区应该作为重要的基因区域。

哈尔滨市新确诊男男同性性接触者HIV-1感染者毒株基因型分析

目的分析哈尔滨市新确诊男男同性性接触者(men who have sex with men,MSM)HIV-1感染病例的毒株基因型特征。方法收集2012-2015年新确诊且未经过抗病毒治疗的HIV-1感染者抗凝血,分离外周血单核细胞,从中提取基因组DNA,采用巢式PCR法扩增gag和env基因。采用MEGA7.0软件构建gag和env基因系统发育树,分析基因型特点。结果共收集148例MSM HIV-1感染者样本,均获得gag和env基因序列。系统发育树显示,其中CRF01_AE亚型108例,占73.0%;B亚型19例,占12.8%;CRF07_BC 12例,占8.1%;独特重组型9例,占6.1%。在不同年份、不同年龄群体的标本中,CRF01_AE均为优势基因型。在CRF01_AE毒株中,98.1%(106/108)与我国MSM人群参考株成簇,1.9%(2/108)与泰国及我国西南地区异性传播参考株成簇。77.8%(7/9)的独特重组型毒株来自20~40岁群体。2012年开始出现gag和env基因间重组亚型,2014年发现gag基因内重组亚型,2015年出现基因内和基因间均发生重组的复杂亚型,尚未发现env基因内重组毒株。结论哈尔滨市2012年至2015年新确诊男男同性性接触人群HIV-1感染病例中流行毒株基因型较复杂,CRF01_AE亚型毒株一直是本地区的优势毒株,同时,基因间和基因内重组毒株已出现。因此,加强MSM人群新发感染病例的实时监测,并制定有效的预防措施是非常必要的。

黑龙江省佳木斯市新确诊HIV-1感染的分子流行病学研究

目的分析黑龙江省佳木斯市新确诊的Ⅰ型人类免疫缺陷病毒感染者病例特征及病毒基因型分布,了解本地区HIV-1流行情况。方法收集57例2016-2017年新确诊HIV-1感染者资料;利用Lag Avidity EIA法判定HIV新发感染病例数;从外周血单个核细胞中提取基因组DNA,扩增gag和env基因并测序;利用Mega软件构建gag和env基因系统发育树,分析基因特点;利用HIV数据库jpHMM软件分析基因重组情况,确定重组体基因型。结果在57例感染者中,新发感染病例38例,占66.7%;通过男男同性性行为感染HIV-1的有53人,占93.0%;通过异性性接触感染HIV-1的有4人,占7.0%。病毒基因型主要分布在4个亚型内,其中CRF01_AE亚型33例,占57.9%;CRF07_BC亚型11例,占19.3%;B亚型6例,占10.5%;A1亚型2例,占3.5%。还发现5例(8.8%)独特重组型,包括2例gag基因内CRF01_AE与B亚型重组病毒,2例CRF07_BC gag和CRF01_AE env基因间重组病毒,1例CRF07_BC gag和B亚型env基因间重组病毒,均在男男同性性行为者中发现。结论男男同性性行为是佳木斯市HIV-1传播的最主要途径,CRF01_AE是本地区的优势HIV-1基因型。男男同性性行为人群已经成为佳木斯市复杂重组病毒的主要源头,实时监测该人群HIV-1新发感染病例和制定有效的防控措施是非常必要的。