HIV-1 CN54 Gag P55和P24蛋白的高效表达、纯化和鉴定

目的 探讨HIV 1中国株CN5 4GagP5 5和P2 4重组蛋白的高效表达并纯化 ,为研究HIV疫苗和诊断试剂创造条件。方法 分别将CN5 4GagP5 5和P2 4基因克隆至 pBV2 2 0和 pThioHisC载体 ,构建非融合表达载体 ;将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1codonplus RIL ,对工程菌进行诱导表达。Western Blot检测目的蛋白 ,用DEAE SeparoseFF阴离子交换层析柱纯化目的蛋白 ;纯化的P5 5和P2 4抗原蛋白分别包被酶标板作ELISA检测。结果 P5 5以包涵体的形式表达 ,表达量占菌体总蛋白的 30 % ,P2 4实现了可溶性表达 ,表达量占总菌体总蛋白的4 0 % ;纯化后P5 5纯度达到 80 % ,P2 4纯度超过 90 %。Western Blot和ELISA检测均显示了良好的的灵敏度和特异性。结论 HIV 1CN5 4GagP5 5和P2 4抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达 ,纯化的抗原蛋白具有良好抗原性 。

HIV-1 P24截短体与gp41截短体的融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

用基因重组技术将截短的HIV 1p2 4基因和gp41基因连接成嵌合基因 ,插入质粒 pGEX 4T3,构建成重组表达质粒pGEX F。将 pGEX F转化大肠杆菌BL2 1。经IPTG诱导表达 ,pGEX F在大肠杆菌BL2 1中获得了高效表达。融合蛋白P2 4 gp41经Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化后 ,用间接ELISA和免疫印迹检测HIV抗体阳性血清和正常人血清 ,P2 4 gp41只与HIV抗体阳性血清反应 ,证明获得的融合蛋白P2 4 gp41有很强的抗原特异性和免疫反应性 。

弓形虫表面抗原P35重组蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 构建弓形虫RH株表面抗原P3 5基因重组表达质粒P3 5 /pGEX 2T ,并在大肠杆菌JM10 9中进行表达、纯化及鉴定。 方法 采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术从弓形虫cDNA文库中扩增出编码P3 5抗原的基因片段 ,克隆入表达载体pGEX 2T ,并在大肠杆菌JM10 9中融合表达 ,经GSTrapTM亲和层析柱纯化出P3 5重组融合蛋白 ,以SDS PAGE电泳鉴定纯度、Western blot鉴定抗原性。 结果 成功构建了重组表达质粒P3 5 /pGEX 2T ,融合表达产物的分子质量约为 70kDa ;该蛋白抗原能为谷胱甘肽S转移酶 (GST)单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。 结论 弓形虫表面抗原P3 5在大肠杆菌中有效表达 。

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型Gag前体蛋白片段在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

利用新型原核表达载体pDOG,在大肠杆菌中高效表达了人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gag基因片段。表达载体利用λPR启动子以及T7g-10的RBS来有效起始表达基因的翻译。表达片段PG1包括p17C-端13个氨基酸、整个p24以及p15N-端74个氨基酸。与PG1相比,PG2片段不含有p17序列,并缺失了p24N-端77个氨基酸。两者的表达量均占总菌体蛋白的20％以上。重组蛋白以包涵体形式存在,在提取包涵体后,经过一步离子柱层析,可以纯化到90％以上的纯度。PG1可被一株抗p24的单抗特异识别,而PG2则不能。纯化的重组蛋白能与HIV-1阳性血清发生很强的特异反应,可以用于HIV-1抗体检测中。

GST-hDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定

目的 构建GST hDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GST hDaxx融合蛋白 ,并研究其与 p5 3的结合能力。方法 构建GST hDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX 4T/hDaxx ,在大肠杆菌 (E .col i)中用异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。表达产物用亲和层析柱加以纯化后 ,Westernblot鉴定表达产物与纯化物。通过共免疫沉淀反应与Westernblot观察hDaxx与p5 3的结合反应。结果 在原核细胞中成功表达了GST hDaxx融合蛋白 ,hDaxx与 p5 3可发生共免疫沉淀反应。 结论 1.GST hDaxx融合蛋白成功表达 ;2 .hDaxx和 p5 3的相互结合提示它们可能与肿瘤的发生有关。

屋尘螨过敏原Der p 4的克隆、表达、免疫原性鉴定及生物信息学分析

目的克隆表达屋尘螨过敏原Derp 4重组蛋白,鉴定其免疫原性并对其生物信息学进行分析。方法根据已知Derp4基因序列,设计PCR引物,提取屋尘螨总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)扩增Derp4基因。将测序正确的基因片段克隆至pET-28a(+)载体,提取质粒测序鉴定,将重组质粒转入Rosetta2(DE3)pLysS感受态细胞,1 mmol/LIPTG诱导表达后,采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况。亲和层析法纯化重组蛋白后,以屋尘螨过敏患者血清为一抗,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫原性。以纯化后的重组蛋白为包被抗原,间接ELISA法检测30份尘螨过敏患者血清IgE,鉴定其特异性。利用ProtParam tools、SignalP5.0、NetPhos3.1、CD-search、Alphafold、Immune Epitope Database and Analysis Resource(IEDB)等软件和生物信息学预测抗原肽(BPAP)系统等对Derp 4的理化性质、信号肽序列、磷酸化位点、二级和三级结构及B细胞抗原表位进行生物信息学分析。结果RT-PCR扩增出长度为1090 bp的条带。重组质粒测序结果显示,插入的片段为全长1090 bp的Derp 4基因序列。SDS-PAGE分析结果显示,Derp 4重组蛋白为包涵体蛋白,相对分子质量(Mr)约60000,经纯化后的重组蛋白纯度>90%。Western blotting分析结果显示,Derp 4重组蛋白可与尘螨过敏患者血清中的IgE特异性结合,在Mr60000处有明显条带。间接ELISA检测结果显示,Der p 4重组蛋白与14份(46.67%)尘螨过敏患者血清呈特异性IgE结合。生物信息学分析显示,Der p 4蛋白稳定性较高,无信号肽结构,二级结构和三级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主;IEDB和BPAP系统预测到Derp4蛋白存在15个B细胞抗原表位肽序列。结论纯化的Der p 4重组蛋白具有免疫原性,与屋尘螨过敏患者血清中的IgE抗体结合较好。

人类获得性免疫缺陷病毒Ⅰ型内壳蛋白p24在大肠埃希菌中的表达与纯化

人类获得性免疫缺陷综合征(ＡｃｑｕｉｒｅｄＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ,ＡＩＤＳ)简称艾滋病,是由人免疫缺陷病毒(ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ,ＨＩＶ)引起的[1,2],根据遗传学和血清学的特征,ＨＩＶ可分为ＨＩＶ1和Ｈ?..

HIV-1中国株CN54 Gag蛋白在毕赤酵母中的表达纯化和鉴定

目的 利用毕赤酵母表达系统高效表达HIV 1中国株CN5 4的Gag蛋白,初步确立发酵和纯化工艺。方法 PCR扩增CN5 4Gag基因,插入毕赤酵母表达载体pPS1 0 ,电转化毕赤酵母菌株GS115 ,G4 18筛选高表达工程菌,利用5L发酵罐进行高密发酵,通过SPSepharoseFF和DEAESeparoseFF柱层析,用HIV 1阳性血清和p2 4抗原检测试剂盒对纯化后的Gag蛋白进行免疫学性质的鉴定。结果 构建了高效表达CN5 4Gag蛋白的毕赤酵母工程菌株,发酵罐培养的菌体密度吸光度(A6 0 0 值)超过30 0 ,Gag蛋白表达量达到12 0mg L。纯化后的Gag蛋白纯度高于90 % ,p2 4检测强阳性并能够与HIV 1阳性血清发生特异的抗原抗体结合反应。结论 本研究在毕赤酵母中高效表达了HIV 1中国株CN5 4的Gag蛋白,并进行了纯化和鉴定,为针对我国新一代HIV蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。

利用新型表达载体一步获得HIV-1核壳蛋白p24纯品

目的 利用新型原核表达载体获得人免疫缺陷病毒 1型 (HIV 1)核壳蛋白p2 4纯品。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增出HIV 1HXB2株gag开放阅读框架的内壳蛋白p2 4的基因片段 ,将目的基因片段插入到新型表达载体pTXB中构建成重组表达质粒pTXB p2 4。表达产物的纯品通过几丁质珠 (chitinbeads)的亲和与柱上DTT的剪切而得到。用SDS PAGE和HPLC分析所得纯品的大小和纯度 ,用Westernblot和胶体金实验检测其抗原性。结果 构建的重组表达质粒pTXB p2 4经IPTG诱导得到C端融合Intein CBD的p2 4蛋白 ,该蛋白通过几丁质珠 (chitinbeads)的亲和与柱上DTT的剪切得到纯化的非融合的p2 4重组蛋白。HPLC分析表明其纯度可达 96 % ,胶体金结果显示纯化的p2 4可与HIV 1阳性患者的血清反应 ,具良好的抗原性。结论 利用新型原核表达载体可一步获得纯度为 96 %的非融合p2 4抗原纯品 ,为大规模生产该蛋白提供了可靠的保证。

集胞藻PCC6803中S2P同源蛋白Slr0643及Sll0862金属蛋白酶活性的体外鉴定

【目的】金属蛋白酶S2P在细菌中通过在膜切割转录调控因子、释放δ因子参与胁迫响应是跨膜信号转导的保守机制,但蓝细菌中S2P的功能还未被鉴定,故我们考察集胞藻PCC6803中的S2P同源蛋白Slr0643及Sll0862的金属蛋白酶活性。【方法】以pET-30b(+)为载体,分别构建重组质粒pF0643和pF0862,在大肠杆菌BL21(CE3)中诱导表达并纯化Slr0643及Sll0862蛋白,以β-酪蛋白为底物检测重组蛋白的酶活性。【结果】体外酶活实验显示重组表达的Slr0643及Sll0862蛋白有内切蛋白酶活性,且其活性受金属螯合剂o-phenanthroline的抑制。体外酶活的鉴定结果为进一步研究Slr0643和Sll0862的体内酶活和生物学功能奠定了基础。【结论】集胞藻PCC6803中的S2P同源蛋白Slr0643及Sll0862具有金属蛋白酶活性。