基于Gal抗原缺失小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞试验敏感性初探

目的:采用腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验考察Gal抗原缺失小鼠评价动物源材料对固有免疫影响的敏感性。方法:Gal抗原缺失小鼠(GGTA1 KO)经兔血预免后,随机分为空白对照组(生理盐水)、地塞米松抑制性阳性对照组、植物血凝素刺激性阳性对照组、牛跟腱样品植入组。地塞米松阳性对照组与植物血凝素阳性对照组参照YY/T 1465.4-2017进行给药。牛跟腱植入组皮下植入牛跟腱(2.4cm2/只),周期为4周。最后所有实验组小鼠均腹腔注射鸡血红细胞,参照YY/T 1465.4-2017计数巨噬细胞和被吞噬的鸡血红细胞个数,并计算吞噬百分数和吞噬指数。结果:Gal抗原缺失小鼠的植物血凝素阳性对照组的细胞吞噬百分数和吞噬指数为39.05%和2.02,略高于空白对照组的32.15%和1.87,但无统计学差异;牛跟腱植入组的细胞吞噬百分数和吞噬指数分别为55%和2.59,均高于空白对照组,存在显著性差异(P<0.01);地塞米松抑制性阳性对照组吞噬百分数和吞噬指数分别为20.60%和1.43,低于空白对照组(P<0.05,P<0.01);研究结果表明,Gal抗原缺失小鼠对植物血凝素有一定程度的刺激反应,而地塞米松可明显降低吞噬百分数和吞噬指数,说明试验体系基本成立。牛跟腱植入物引起了吞噬细胞吞噬百分数和吞噬指数的显著升高,提示牛跟腱具有免疫原性风险。结论:在腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞试验中,Gal抗原缺失小鼠对地塞米松抑制性阳性对照表现出显著的抑制效应,而牛跟腱植入物的刺激引起了明显的刺激效应,表明Gal抗原缺失小鼠对于评价动物源性生物材料对固有免疫的影响具有一定应用价值。

Gal抗原缺失小鼠的应用示范:动物源性硬脑膜补片的免疫原性反应评价

目的:采用Gal抗原缺失模式小鼠评价动物源性硬脑膜补片残余免疫原风险,考察Gal抗原缺失模式小鼠的应用价值。方法:在经外源性Gal抗原(兔血红细胞)预免的Gal抗原缺失小鼠皮下分别植入硬脑膜补片(产品)与牛心包(原材料)4周,分析小鼠血清总抗体,特异性抗-Gal抗体,与免疫排斥反应及炎症反应相关的细胞因子表达水平,脾脏淋巴细胞亚型及胸腺、局部病理,综合考察各实验组的差异。结果:牛心包植入组与对照组相比,小鼠血清抗-Gal IgG和抗-Gal IgM水平显著升高(分别为约4倍和约1.7倍);而硬脑膜补片植入组小鼠血清抗-Gal IgG、抗-GalIgM水平与对照组相比均无明显差异。除硬脑膜补片植入组小鼠血清IL-4含量下降之外,其余细胞因子包括IL-1β、IL-10、IL-2、IL-6、IL-12P70与IFN-γ含量,血清总IgG、IgM水平在各组间均无显著差异。脾脏淋巴细胞亚型分析显示,硬脑膜补片植入组和心包植入组与对照组相比均无显著性变化。胸腺病理未见异常;局部病理显示硬脑膜补片植入组炎症:Ⅰ-Ⅱ级,纤维化:Ⅰ-Ⅱ级,较心包植入组(炎症:Ⅱ-Ⅲ级,纤维化:Ⅱ-Ⅲ级)反应减轻。研究结果表明动物源性硬脑膜补片产品的Gal抗原介导的免疫原性反应与原材料相比显著降低。然而,硬脑膜补片植入组的植入物局部仍存在一定程度的炎症反应和纤维化现象。结论:硬脑膜补片残余免疫原风险与原材料相比显著降低,与对照组无显著性差异;Gal抗原缺失模式小鼠血清抗-Gal IgG、抗-Gal IgM能够科学地评价动物源性生物材料Gal抗原相关的免疫原性,可以作为动物源性生物材料脱抗原处理工艺有效性的特异性指标之一;提示Gal抗原缺失模式小鼠对动源性生物材料的异种免疫原性风险评价具有极高的应用价值。

应用Gal抗原缺失小鼠评价可降解异种脱细胞真皮基质的免疫原性

目的:采用Gal抗原缺失小鼠评价脱细胞真皮基质及其降解过程中的残余免疫风险。方法:Gal抗原缺失小鼠经兔血预免后,随机分为对照组、T1组、T2组。T1组腿部肌肉间植入牛真皮基质(原材料),T2组肌肉间植入脱细胞真皮基质,对照组进行"假手术"操作。在植入后的4、12、52周分别取材,用ELISA方法检测小鼠血清总IgG、IgM含量和血清抗-Gal IgG、IgM水平;用流式细胞仪检测血清IL-4、IL-10、IL-12p40、IFN-γ等细胞因子含量,以及脾淋巴细胞亚型百分比等;进行脾体外淋巴细胞增殖试验,采用CCK-8试剂检测淋巴细胞增殖率;取胸腺、脾脏以及包裹植入物的局部肌肉样本,HE染色后进行组织病理学评价。通过与对照组的比较,进行牛真皮基质原材料和脱细胞真皮基质的免疫毒理学风险评价。结果:与对照组相比,小鼠植入牛真皮基质原材料的T1组小鼠血清抗-Gal IgG含量和体外脾脏淋巴细胞增殖率有统计学显著性差异。T1组小鼠在4周时,血清抗-Gal IgG平均含量是对照组的2倍;植入12周时,血清抗-Gal IgG平均含量继续升高,达到对照组的近7倍,统计学分析均有显著性差异,表明由降解引起的Gal抗原持续暴露或暴露增加,致使小鼠血清抗-Gal IgG含量升高;在植入52周时,血清抗-Gal IgG平均含量回复到对照组水平。植入12周时,T1组小鼠的脾淋巴细胞体外培养3、7d时,淋巴细胞增殖率分别是对照组的211%和243%。组织病理学分析显示T1组牛真皮基质植入后4周时局部反应为重度刺激,12周时为中度刺激,52周时为轻微刺激。植入脱细胞真皮基质的T2组在4、12、52周的不同时点,小鼠血清总IgG、IgM含量,抗-Gal IgG和IgM含量,血清细胞因子,脾淋巴细胞分型和淋巴细胞体外增殖等不同指标的检测结果与对照组相比均无统计学差异;组织病理学分析显示T2组脱细胞真皮基质植入后4周时局部反应为中度刺激,12周时为轻微刺激,52周时为无刺激。而且,脱细胞真皮基质在4、12、52周时的植入局部反应明显低于真皮基质原材料。结论:牛真皮基质(原材料)及其降解产物具有引起Gal抗原缺失小鼠血清抗-Gal IgG含量升高和脾脏淋巴细胞增殖的免疫原性;而脱细胞真皮基质在植入后降解过程中的免疫反应与对照组相比均无显著性差异。这些结果表明脱细胞处理工艺降低了脱细胞真皮基质的特异性免疫反应。

采用Gal抗原缺失鼠评价GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织的免疫原性

目的比较在Gal抗原缺失小鼠皮下分别植入GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织与野生型猪软骨组织所引起的免疫反应。方法将三基因敲除猪软骨组织(KO组)与野生型猪软骨组织(WT组)分别植入Gal抗原缺失小鼠皮下4周,设立假手术组(con)作为阴性对照。4周后抽取小鼠血清检测总IgM抗体和抗Gal抗体。结果野生型猪软骨(WT)材料植入组小鼠总IgM含量平均在(0.525±0.224)mg/ml,显著高于阴性对照(Con)组小鼠总IgM平均含量(0.121±0.050)mg/ml(P<0.05),但与三基因敲除猪软骨(KO)组小鼠总IgM平均含量(0.313±0.061)mg/ml无统计学差异。野生型猪软骨组织具有比三基因敲除猪软骨组织组和对照组更高的抗α-Gal IgM水平(P<0.05),而三基因敲除组与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。结论上述结果表明GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织在体内几乎没有免疫反应,可作为软骨缺损修复材料。

不同种属小鼠用于淋巴细胞增殖试验的比较研究

目的:对使用不同种属小鼠进行脾淋巴细胞增殖试验的适宜性和可比性进行研究。方法:分别获取BALB/c小鼠、野生型C57BL/6(简称C57)小鼠、Gal抗原缺失(C57背景,GGTA1基因被敲除)小鼠的脾淋巴细胞,在确定脾淋巴细胞数量与CCK8吸收度的线性范围后,设立阳性对照组(刀豆蛋白A,Con A)、不同稀释度的动物原材料匀浆液和脱细胞生物材料匀浆液等试验组,使用CCK8检测淋巴细胞增殖,流式细胞术测定淋巴细胞亚型百分比,以确定BALB/c小鼠、野生型C57小鼠和Gal抗原缺失小鼠在体外淋巴细胞增殖试验的适宜性和可比性。结果:C57小鼠脾淋巴细胞数量和CCK8的吸收度的线性范围要明显大于BALB/c小鼠,而BALB/c小鼠线性曲线的斜率明显大于C57小鼠。从CCK8检测的淋巴细胞增殖结果看,BALB/c小鼠与C57小鼠相比,2.5μg·mL-1的Con A对2种小鼠脾淋巴细胞增殖均出现明显刺激作用;牛跟腱(含低水平的Gal抗原)匀浆液对2种小鼠脾淋巴细胞增殖均显示刺激作用,并显示出量效关系;不同稀释度的胶原海绵(牛跟腱来源)匀浆液对2种小鼠脾淋巴细胞增殖均未显示刺激作用,表现了一致的结果,说明没有淋巴细胞促增殖作用。另外,来源于Gal抗原缺失小鼠与野生型C57小鼠的脾脏淋巴细胞对Con A、牛心包(含有高水平的Gal抗原)匀浆液均表现出强的增殖反应和相似的反应强度。流式细胞术检测结果显示牛心包匀浆原液组在Gal抗原缺失小鼠仅显示活化B细胞百分比与对照组相比有统计学显著性差异,而在野生型C57小鼠组其活化B细胞、活化T细胞、活化NK细胞、NKT细胞、CD4 T细胞百分比与对照组相比均有统计学显著性差异。结论:CCK8检测的各试验组淋巴细胞增殖率结果在C57小鼠与BALB/c小鼠、Gal抗原缺失小鼠与野生型C57小鼠间具有可比性,表明这些种属的小鼠均可用于体外淋巴细胞增殖试验。

去细胞异种角膜基质与去细胞异种结膜基质的免疫原性研究

目的:应用Gal抗原缺失小鼠从体液免疫、细胞免疫、植入物局部组织病理等多方面评价去细胞异种角膜基质(猪源)与去细胞异种结膜基质(猪源)的免疫原性。方法:将用于每种材料的小鼠分为3个实验组:对照组(Con)、原材料组(T1)和基质组(T2)。将去细胞异种角膜基质与去细胞异种结膜基质及其原材料植入经兔血红细胞2次预免疫的Gal抗原缺失小鼠体内,于植入1个月后取材,分别分析2种基质及其原材料组与对照组在小鼠血清总抗体、抗-Gal抗体、细胞因子,脾脏淋巴细胞不同亚型的细胞表面分子表达水平,以及植入物局部组织病理等方面的变化。结果:2种基质及其原材料组在植入1个月后小鼠血清总抗体含量、细胞因子含量与对照组相比均无显著性差异。少数脾脏淋巴细胞表面分子表达水平与对照组相比有显著性差异(P<0.05),但均在对照组历史数据变异范围内。然而,小鼠血清抗Gal抗体检测结果显示:去细胞异种结膜基质植入1个月时基质及其原材料组小鼠血清抗-Gal抗体水平比对照组显著升高(P<0.05);而去细胞异种角膜基质植入1个月时基质及其原材料组小鼠血清抗-Gal抗体水平与对照组相比均无显著性差异。植入物局部组织病理显示:去细胞异种结膜基质植入1个月时大部分已降解,组织学显示轻微炎症反应,原材料组已无材料残留,组织学显示无明显炎症反应。去细胞异种角膜基质及原材料组植入1个月时植入物未发生明显降解,基质及原材料组的组织学反应均为重度炎症反应。结论:本研究结果证实了Gal抗原缺失小鼠对材料中残留Gal抗原的敏感性,应用Gal抗原小鼠能够科学地评价动物源性生物材料的异种免疫原性风险。