伏核神经细胞GalR2介导针刀干预神经病理性痛大鼠的镇痛作用

目的研究伏核(nucleus accumbens,NAc)神经细胞甘丙肽受体2(galanin receptor 2,GalR2)激活介导针刀干预神经痛的作用机制。方法采用左侧坐骨神经部分结扎(chronic constriction injury,CCI)制作神经痛动物模型,通过测定大鼠对伤害性热刺激诱导的后爪缩爪潜伏期(hind paw withdrawal latency,HWL)和机械刺激诱导的后爪缩爪阈值(hind paw withdrawal threshold,HWT)来检测痛觉阈值。Western blot法检测针刀治疗对CCI大鼠伏核神经细胞GalR2表达的影响,并于CCI大鼠伏核内微量注射甘丙肽受体的阻断剂后,检测其对针刀干预神经痛的痛觉阈值的影响。结果CCI大鼠伏核内注射2 nmoL甘丙肽受体的非特异性阻断剂Galantide减弱了针刀疗法引起的HWL(左侧:P<0.001;右侧:P<0.05)和HWT(左侧:P<0.01;右侧:P<0.05)的延长,但注射1 nmoL的Galantide没有显著性差异(P>0.05)。针刀治疗引起CCI大鼠伏核神经细胞GalR2的表达上调(P<0.01),且注射2 nmoL的GalR2的特异性阻断剂M871后削弱了针刀疗法引起的HWL(左侧:P<0.001;右侧:P<0.001)和HWT(左侧:P<0.001;右侧:P<0.01)。结论CCI大鼠伏核神经细胞GalR2激活可能介导了针刀干预神经痛的镇痛作用。

GAL/GALR2促进涎腺腺样囊性癌细胞神经侵袭的研究

目的:探究甘丙肽(Galanin,GAL)和甘丙肽2型受体(GALR2)在涎腺腺样囊性癌(SACC)神经侵袭中的作用。方法:将SACC细胞与小鼠背根神经节(DRG)共培养。qRT-PCR、Western Blot检测SACC细胞GALR2的表达;CCK-8、流式细胞术、划痕、Transwell检测GAL对SACC细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响;神经侵袭实验检测GALR2阻滞(M871)对SACC细胞神经侵袭的影响。结果:共培养SACC细胞GALR2表达显著升高(P<0.05);GAL促进了SACC细胞增殖、迁移侵袭,抑制凋亡(P<0.05);M871可抑制SACC细胞神经侵袭。结论:神经来源GAL可激活SACC细胞的GALR2,促进其神经侵袭。

GalR2基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建GalR2基因真核表达质粒,并在HeLa细胞中表达。方法从C57BL∕6J小鼠海马组织中提取总RNA,RT-PCR法扩增GalR2基因,克隆至pEGFP-C1载体中,构建重组真核表达质粒pEGFP-GalR2。将重组表达质粒转染至HeLa细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的定位,RT-PCR和Western blot分别检测GalR2基因的转录及表达。结果从C57BL∕6J小鼠海马组织扩增出1 116 bp的GalR2基因;重组表达质粒pEGFP-GalR2经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;转染细胞融合基因的表达产物定位于细胞核,GalR2基因在mRNA及蛋白水平上均有表达。结论已成功构建了GalR2基因真核表达质粒pEGFP-GalR2,并在HeLa细胞中成功表达了GalR2蛋白,为进一步探讨GalR2的生物学活性奠定了基础,也为寻找抗抑郁药物的靶点提供了新的思路。

GalR2基因的表达对小鼠抑郁症影响的初步探讨

目的建立C57BL/6J小鼠抑郁症模型,探讨GalR2基因表达对小鼠抑郁症的影响。方法脂质体转染重组真核表达质粒pEGFP-GalR2至人宫颈癌细胞系Hela细胞,Western blotting检测GalR2基因在细胞内的表达。参照CUMS和CORT建模方法构建小鼠抑郁症模型。侧脑室注射脂质体包裹的pEGFP-GalR2质粒,观察GalR2基因表达对小鼠抑郁症的影响。结果通过Western blotting鉴定了GalR2基因获得表达。抑郁症模型小鼠体重增加量、摄食量、液体消耗实验中糖水消耗和糖水偏爱百分比均明显下降,纯水消耗显著提高;强迫游泳实验中挣扎时间和游泳时间缩短,不动时间延长。侧脑室注射pEGFP-GalR2后小鼠行为学改变未得到有统计学意义的结果。结论成功鉴定了GalR2基因在细胞内的表达。成功构建C57BL/6J小鼠抑郁症模型。CORT模型造模效果要优于CUMS模型。GalR2蛋白对抑郁症的影响有待后续实验进一步探讨。

甘丙肽2型受体对氧化应激海马神经元自噬的调控作用及机制研究

本研究旨在解析仔猪脑海马甘丙肽2型受体(galanin receptors type 2,GALR2)参与氧化应激调节的分子机制.本研究基于成功构建的仔猪活体和大鼠海马神经元氧化应激模型,采用实时PCR技术考察仔猪脑海马和大鼠海马神经元GALR2的表达变化.并采用实时PCR、蛋白质印迹法及透射电镜技术进一步探索GALR2介导的信号途径和自噬之间的关系.结果发现,与对照组相比,氧化应激仔猪脑海马与大鼠海马神经元GALR2的转录水平上调(P<0.01;P<0.05).同时,氧化应激神经元自噬相关基因LC3、ATG5与Beclin-1的转录水平均上调(P<0.05;P<0.05;P<0.01).相关性分析结果显示,GALR2与LC3、ATG5及Beclin-1的转录水平正相关(P<0.05;P<0.05;P<0.01).GALR2特异性抑制剂M871的处理降低氧化应激海马神经元的活力(P<0.01)、抑制氧化应激引起的自噬小体数量增多(P<0.01)、自噬相关基因LC3、Beclin-1及ATG5转录水平的上调(均P<0.01)以及LC3-Ⅱ/β-actin比值与P62蛋白质水平的升高(均P<0.05),表明伴随GALR2表达水平的抑制,被氧化应激上调的海马神经元自噬效应被抑制,从而削弱对氧化损伤的抵抗,降低了神经元的活力.与此同时,M871的处理也降低了被氧化应激上调的JNK蛋白表达量(P<0.01)及磷酸化水平(P<0.05),表明JNK是GALR2调控海马神经元氧化应激的下游靶酶.而JNK特异性抑制剂SP600125的处理则下调了被氧化应激上调的自噬标记蛋白LC3-Ⅱ/β-actin比值(P<0.01),表明氧化应激状态下,抑制的JNK阻碍了神经元中上调的GALR2对自噬信号通路的激活.综上可见:氧化应激状态下,海马神经元中上调的GALR2可通过调节JNK信号途径激活细胞自噬途径,从而降低神经元的氧化应激损伤,保护神经元.

甘丙肽受体2基因敲除小鼠的饲养繁育及基因型鉴定

目的饲养和繁育甘丙肽受体2基因敲除小鼠,对小鼠基因型进行分析和鉴定,并验证检测方法的适用性。方法将引进的GalR2基因敲除杂合子雄性小鼠和野生型雌性小鼠以1∶2的比例,或杂合子雌性小鼠和野生型雄性小鼠以2∶1的比例进行交配繁殖,获得的F1代杂合子小鼠进行同胞交配,获得F2代纯合子、杂合子和野生型小鼠。小鼠为2周龄时将其鼠尾剪取2~5 mm以获取组织DNA,使用PCR对目的基因片段进行扩增,并使用琼脂糖凝胶电泳法对基因型结果进行判定。结果GalR2基因敲除小鼠能够稳定繁育,并获得了一批基因敲除小鼠。F1代杂合子小鼠交配获得了3种基因型小鼠:纯合子(GalR2^(-/-)),杂合子(GalR2^(+/-))及野生型(GalR2^(+/+)),使用PCR法鉴定出小鼠的基因型。结论使用科学的繁育方式,以及通过PCR法进行基因型鉴定可以获得甘丙肽受体2基因敲除小鼠。

甘丙肽受体2在病理性疼痛中的研究进展

甘丙肽是一种具有多功能的神经肽,通过激活其受体发挥作用。甘丙肽受体(galanin receptor,GalR)有3 种:GalR1、GalR2、GalR3,GalR2 作为一种G-蛋白偶联受体,广泛分布于中枢神经系统及外周,参与了多种生理病理过程,研究发现其在病理性疼痛中发挥重要作用。结合近年的研究结果对GalR2 的结构、分布及功能,GalR2 在炎症痛、神经病理性疼痛、癌症痛中的研究进展进行综述。

甘丙肽2型受体在HEK293细胞中的表达及内化过程

构建了在甘丙肽2型受体(GalR2)N端带myc表位标签的真核表达载体,并将其转染到HEK293细胞,进而应用免疫荧光细胞化学方法结合激光扫描共聚焦显微技术观察GalR2蛋白的亚细胞分布和膜转运过程。Western blot结果发现转染组myc-GalR2蛋白水平呈高表达。myc-GalR2主要分布在细胞膜上,少量分布于胞浆中。当给予甘丙肽(10-7mol/L)刺激后,5min时可见细胞膜上myc-GalR2明显减少,胞浆内myc-GalR2增多,15min时膜上myc-GalR2几乎全部消失。表明GalR2受体与配体结合后发生内化,且受体蛋白内化为时间依赖性的转运过程,证实在HEK293细胞GalR2会出现配体依赖性内化。同时,以已知膜蛋白5-HT1AR的内化作为对照,可见在给予甘丙肽刺激以后,5-HT1AR没有发生内化,受体蛋白仍然表达在膜上。此外,通过测定胞内钙水平激活情况来检测其信号通路激活情况,表明myc对GalR2功能没有明显影响。

人甘丙肽2型受体基因启动子的克隆与初步功能分析

人甘丙肽2型受体(GalR2)作为G蛋白偶联受体,其功能已被广泛研究,但GalR2基因的转录调控机制尚不明确。我们利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增人GalR2基因上游1121 bp的片段,再通过PCR方法将其缺失成3段长度不等的片段,然后分别将其克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,并将相应的质粒命名为pGL3-B-1121、pGL3-B-922、pGL3-B-521和pGL3-B-200;通过荧光素酶活性分析检测不同长度的GalR2基因启动子在人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)中的活性,发现GalR2基因上游1121 bp区段具有明显的转录活性,缺失-1121到-922 bp区域引起启动子活性的明显增高,暗示该区域存在负调控元件;利用TESS在线软件分析GalR2基因上游序列,发现该基因启动子含有Sp1、AP-1、AP-2、NF-1、YY1和ERα等多种顺式作用元件。因此,本实验初步确定了人GalR2基因启动子的转录调节区,为进一步研究该基因转录调控机制奠定了基础。

甘丙肽2型受体在HEK293A细胞中的同源二聚化研究

G蛋白偶联受体二聚化在受体的转运和信号转导中起着重要的调节作用。为了验证甘丙肽2型受体(GalR2)是否形成同源二聚体,本实验分别构建了N端带FLAG和HA标签的GalR2融合蛋白,并转染到HEK293A细胞中。Western blot发现,除了相当于GalR2分子量的位置有条带之外,在大约2倍于GalR2分子量的位置也有条带,提示GalR2可能是以二聚体的形式存在的。共转染HA-GalR2和FLAG-GalR2,通过免疫共沉淀方法,在抗HA的免疫片段中检测到了FLAG的免疫活性,且在相当于单倍分子量和二倍分子量上均有条带;反过来,在FLAG的免疫片段中检测HA的免疫活性,条带同样出现在单倍分子量和二倍分子量上。以上结果表明甘丙肽2型受体之间形成了同源二聚体。