甘丙肽受体2基因敲除小鼠的饲养繁育及基因型鉴定

目的饲养和繁育甘丙肽受体2基因敲除小鼠,对小鼠基因型进行分析和鉴定,并验证检测方法的适用性。方法将引进的GalR2基因敲除杂合子雄性小鼠和野生型雌性小鼠以1∶2的比例,或杂合子雌性小鼠和野生型雄性小鼠以2∶1的比例进行交配繁殖,获得的F1代杂合子小鼠进行同胞交配,获得F2代纯合子、杂合子和野生型小鼠。小鼠为2周龄时将其鼠尾剪取2~5 mm以获取组织DNA,使用PCR对目的基因片段进行扩增,并使用琼脂糖凝胶电泳法对基因型结果进行判定。结果GalR2基因敲除小鼠能够稳定繁育,并获得了一批基因敲除小鼠。F1代杂合子小鼠交配获得了3种基因型小鼠:纯合子(GalR2^(-/-)),杂合子(GalR2^(+/-))及野生型(GalR2^(+/+)),使用PCR法鉴定出小鼠的基因型。结论使用科学的繁育方式,以及通过PCR法进行基因型鉴定可以获得甘丙肽受体2基因敲除小鼠。

GalR2基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建GalR2基因真核表达质粒,并在HeLa细胞中表达。方法从C57BL∕6J小鼠海马组织中提取总RNA,RT-PCR法扩增GalR2基因,克隆至pEGFP-C1载体中,构建重组真核表达质粒pEGFP-GalR2。将重组表达质粒转染至HeLa细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的定位,RT-PCR和Western blot分别检测GalR2基因的转录及表达。结果从C57BL∕6J小鼠海马组织扩增出1 116 bp的GalR2基因;重组表达质粒pEGFP-GalR2经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;转染细胞融合基因的表达产物定位于细胞核,GalR2基因在mRNA及蛋白水平上均有表达。结论已成功构建了GalR2基因真核表达质粒pEGFP-GalR2,并在HeLa细胞中成功表达了GalR2蛋白,为进一步探讨GalR2的生物学活性奠定了基础,也为寻找抗抑郁药物的靶点提供了新的思路。

GalR2基因的表达对小鼠抑郁症影响的初步探讨

目的建立C57BL/6J小鼠抑郁症模型,探讨GalR2基因表达对小鼠抑郁症的影响。方法脂质体转染重组真核表达质粒pEGFP-GalR2至人宫颈癌细胞系Hela细胞,Western blotting检测GalR2基因在细胞内的表达。参照CUMS和CORT建模方法构建小鼠抑郁症模型。侧脑室注射脂质体包裹的pEGFP-GalR2质粒,观察GalR2基因表达对小鼠抑郁症的影响。结果通过Western blotting鉴定了GalR2基因获得表达。抑郁症模型小鼠体重增加量、摄食量、液体消耗实验中糖水消耗和糖水偏爱百分比均明显下降,纯水消耗显著提高;强迫游泳实验中挣扎时间和游泳时间缩短,不动时间延长。侧脑室注射pEGFP-GalR2后小鼠行为学改变未得到有统计学意义的结果。结论成功鉴定了GalR2基因在细胞内的表达。成功构建C57BL/6J小鼠抑郁症模型。CORT模型造模效果要优于CUMS模型。GalR2蛋白对抑郁症的影响有待后续实验进一步探讨。

人甘丙肽2型受体基因启动子的克隆与初步功能分析

人甘丙肽2型受体(GalR2)作为G蛋白偶联受体,其功能已被广泛研究,但GalR2基因的转录调控机制尚不明确。我们利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增人GalR2基因上游1121 bp的片段,再通过PCR方法将其缺失成3段长度不等的片段,然后分别将其克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,并将相应的质粒命名为pGL3-B-1121、pGL3-B-922、pGL3-B-521和pGL3-B-200;通过荧光素酶活性分析检测不同长度的GalR2基因启动子在人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)中的活性,发现GalR2基因上游1121 bp区段具有明显的转录活性,缺失-1121到-922 bp区域引起启动子活性的明显增高,暗示该区域存在负调控元件;利用TESS在线软件分析GalR2基因上游序列,发现该基因启动子含有Sp1、AP-1、AP-2、NF-1、YY1和ERα等多种顺式作用元件。因此,本实验初步确定了人GalR2基因启动子的转录调节区,为进一步研究该基因转录调控机制奠定了基础。