Effect of antisense human telomerase RNA on malignant behaviors of gastric carcinoma cell line SGC-7901

Objective:To studytheeffectsof antisensehumantelomeraseRNA(ahTR)transfectionon themalignantbeha-viorsof gastriccarcinomacelllineSGC-7901anditspotentialroleingenetherapyfortumor.Methods:AnantisensehTR eukaryoticexpressionvectorcontainingthesequenceof templateregionof telomererepeatswas transfectedintogastric carcinomacelllineSGC-7901withliposomeDOTAP.Theexpressionsof hTRRNAandantisensehTRRNAwereob-servedwithRT-PCR,telomeraseactivitywithPCR-ELISA.Telomerelengthwas measuredwithSouthernblot.Cellmor-phologyandcellularproliferationcapacitywerestudiedwithMTTassay.Cellcycledistributionandapoptoticstatewere observedwithflowcytometry.Efficiencyof cloneformationin softagarandtumorigencityin nudemicewereexamined andevaluatedinahTR-transfected7901cells,andplasmidpCL-neotransfected7901cellsandparental7901cellsserved as control.Results:AnantisensehTReukaryoticexpressionvectorwastransfectedinto7901cellssuccessfully.Thetelom-eraseactivityin ahTR-transfected7901cellswas decreasedfrom100%to about25%,andtelomerelengthin thecells shortenedfrom4.08kb to3.35kb at60populationdoublings(PDs).Comparedwithparental7901andpCL-neotransfect-ed7901cells,ahTR-transfected7901cellsdisplayedsomemorphologicalchanges,includingdecreasedcellatypiaandnu-cleus/cytoplasmratiounderlightmicroscope.Furthermore,ahTR-transfected7901cellsdisplayedgrowthinhibition,de-creasedinvasivecapacityin Borden’schamberinvasivemodel,increasedG 0 /G 1 phaserateandapoptoticrate,andrestored contactinhibitionanddensityinhibition.Surprisingly,ahTR-transfected7901cellslosttheircapacityof cloneformationin softagarandcarcinogensisinnudemice.Conclusion:AntisensehTRtransfectioncaninduce7901celldifferentiationand reverseitsmalignantphenotype.Thisstudyprovidesan excitingapproachfor cancertherapythroughtheinhibitionof telomeraseactivitywithantisensegeneandothertelomeraseinhibitors.

乳腺癌端粒酶活性与bcl-2和bax蛋白表达的相关性研究

目的 探讨端粒酶检测在乳腺癌诊断中的作用及其在乳腺癌发生中与bcl 2和bax蛋白表达的相关性。方法 用原位杂交方法检测端粒酶的表达及其活性 ,采用免疫组织化学技术SABC法检测bcl 2和bax。结果 端粒酶在乳腺癌中的表达率明显高于癌前病变 (P <0 .0 1 )和乳腺良性肿瘤。端粒酶活性与bcl 2表达负相关 ,与bax表达显著负相关 ,与bcl 2 /bax比值明显正相关。结论 bcl 2 /bax表达失衡 (比值增大 )可能是端粒酶激活的重要途径之一。

反义hTR对人胃癌细胞株SGC-7901恶性表型的逆转作用

目的 探讨反义hTR基因转染对胃癌细胞系SGC 790 1恶性表型的逆转作用及其在肿瘤基因治疗中的价值。方法 构建包含端粒重复序列模板区的反义hTR基因真核表达载体 ,用脂质体法将其转染至胃癌细胞系SGC 790 1,比较观察反义hTR基因转染后 790 1细胞的hTRRNA表达、端粒酶活性、体外生长增殖特性和裸鼠体内致瘤能力的变化。结果 反义hTR基因转染的 790 1细胞hTRRNA表达和端粒酶活性明显降低、体外生长增殖能力降低、接触抑制恢复、细胞凋亡率增加、软琼脂集落形成能力和裸鼠体内致瘤能力完全消失。结论 反义hTR基因转染能使 790 1细胞的端粒酶活性明显下调并逆转其恶性表型 ,提示端粒酶是肿瘤治疗的较理想靶点 ,端粒酶抑制剂具有良好的临床应用前景。

端粒酶基因与凋亡相关基因在乳腺导管非典型增生中表达的相关性研究

背景与目的:近年研究表明端粒酶的激活及凋亡抑制基因的过度表达与多种肿瘤发生有关,本研究观察端粒酶基因(hTR,hTRT)、凋亡相关基因(p53,bcl-2)在乳腺导管非典型增生中的表达及相互关系,旨在探讨端粒酶活性及凋亡相关基因的变化在乳腺导管非典型增生上皮癌变过程中的作用和意义。方法:应用原位杂交方法检测端粒酶基因(hTR,hTRT)和凋亡相关基因(p53,bcl-2)mRNA在44例乳腺导管非典型增生组织中的表达,应用免疫组化方法检测p53蛋白在上述病例中的表达,并与6例良性乳腺增生及26例乳腺癌病例进行了比较。结果:端粒酶基因(hTR,hTRTmRNA)在乳腺导管重度非典型增生组织中表达增强(60.9%,52.1%),其表达与在轻、中度非典型增生(22.2%,11.1%;33.3%,25.0%),乳腺癌(88.5%,80.8%)组织中的表达差异显著(P<0.05)。p53mRNA在乳腺导管非典型增生组织中的表达随着异型性的增加而下降(轻度:55.6%;中度:41.7%;重度:26.1%),而p53蛋白则相应增加(轻度:11.1%;中度:25.0%;重度:34.8%)。bcl-2在乳腺导管非典型增生组织中呈中度表达,其中以在重度非典型增生组织中表达明显。结论:端粒酶基因(hTR,hTRT)的表达与乳腺非典型增生细胞的恶性转化密切相关,同时可检测到p53mRNA的表达缺失、p53蛋白突变及bcl-2mRNA的过表达。

原发性胆囊癌基因研究现状

原发性胆囊癌是常见的消化系恶性肿瘤之一,恶性程度较高,长期以来一直严重威胁着人类的健康,对原发性胆囊癌的早期诊断和治疗至今未取得突破性的进展,是临床急需解决的重要问题.从基因学出发研究原发性胆囊癌的发病机制、早期诊断及治疗,已取得了一定的成绩,也是目前肿瘤研究的热点.本文就目前原发性胆囊癌发病过程中的癌基因、抑癌基因与胆囊癌转移、预后及治疗相关基因,肿瘤标志物的研究状况作以综述.

PTEN基因蛋白在胆囊癌组织中表达的研究

目的 :探讨抑癌基因PTEN蛋白在胆囊癌组织中的表达情况及其临床病理意义。方法 :应用免疫组化对 2 8例胆囊腺癌 ,4例胆囊鳞癌及其相应癌旁组织中PTEN蛋白进行检测 ,并结合患者的临床病理资料进行分析。结果 :PTEN蛋白在 32例癌旁组织中全都呈阳性表达 ,而癌组织中PTEN阳性表达率仅 34.4 %。胆囊癌组织中PTEN蛋白阳性表达与患者性别、年龄及组织类型无明显相关性 ,但与组织分化程度明显相关。结论 :PTEN蛋白在胆囊癌组织中阳性表达率较低 ,说明该基因失活可能在胆囊癌发生发展中起重要作用。

端粒酶与bcl-2及bax蛋白在宫颈癌中表达的相关性研究

目的:探讨端粒酶检测在宫颈癌诊断中的作用及其在宫颈癌发生中与bcl-2和bax蛋白表达的相关性。方法:用原位杂交方法检测端粒酶的表达及其活性,采用免疫组织化学Envision法检测bcl-2和bax。结果:端粒酶在宫颈癌中的表达率明显高于癌前病变(P<0.01)和宫颈良性肿瘤。端粒酶活性与bcl-2表达呈负相关,与bax表达呈显著负相关,与bcl-2/bax比值明显正相关。结论:bcl-2/bax表达失衡(比值增大)可能是端粒酶激活的重要途径之一。

HBV感染与hTERT基因表达在肝细胞癌组织中的相关性研究

目的 :研究hTERT基因在HBsAg阳性与阴性肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)患者组织中表达的差异 ,探讨HBV病毒感染与hTERT基因表达在HCC中的相关性。方法 :应用免疫组化 (SP法 )和半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)分别检测 73例HCC患者组织中hTERT蛋白及其mRNA的表达情况 ,其中HBsAg阳性 5 3例 ,HBsAg阴性 2 0例 ,比较二者表达的差异。结果 :hTERT蛋白在HBsAg阳性HCC组织中的阳性表达为 48/5 3 ,在HBsAg阴性HCC组织中阳性表达为 12 /2 0 ,两组病例hTERT蛋白表达阳性率差异有统计学意义 ,P <0 0 1;hTERTmRNA在HB sAg阳性HCC组织中阳性表达为 46/5 3 ,hTERTmR NA在HBsAg阴性HCC组织中阳性表达为 11/2 0 ,两组病例hTERTmRNA表达阳性率差异有统计学意义 ,P <0 0 5 ;统计学分析显示 ,HCC中HBsAg与hTERTmRNA的表达有显著关联性 ,与hTERT蛋白的表达强度成系统性的线性趋势 ,P <0 0 1。结论 :HBsAg阳性HCC组织中hTERT基因表达的阳性率和阳性强度均明显高于HBsAg阴性HCC组织 ,差异有统计学意义 ,P <0 0 5 ;HCC中HBV病毒感染与hTERT基因表达之间具有相关性 。

胆囊癌hTR锤头状核酶基因真核表达载体的构建

目的 用反转录PCR法 ,调取胆囊癌细胞内的端粒酶RNA(hTR)基因 ,并针对其序列设计锤头状核酶切割基因序列 ,并将其构建入真核表达载体pTriEx 4内。方法 根据hTRcDNA序列 ,设计引物 ,经RT PCR法从体外培养的胆囊癌细胞内调取hTR模板区基因 ,根据其测序结果 ,合成锤头状核酶基因 ,与经相应酶切的真核表达载体连接 ,酶切鉴定重组体的正确性。结果 经RT PCR从细胞内调出 6 8bp序列 ,与hTRcDNA比较 ,与模板区域碱基序列一致。核酶基因重组子经酶切鉴定序列正确。结论 RT PCR法可调出胆囊癌hTR基因有效片段 ;成功构建了针对hTR模板区的核酶基因的真核表达载体 。

端粒酶基因hTR在乳腺癌中的表达

用原位杂交的方法检测端粒酶基因 h TR在 4 6例乳腺癌及其癌旁组织、5 3例乳腺良性病变中的表达和分布情况。结果显示 ,4 6例乳腺癌中 h TR表达阳性率为 91.3% ;癌旁组织中为 0 ;5 3例乳腺良性病变中为3.9%。乳腺癌组织中 h TR的表达与癌旁组织、良性病变比较差异有显著性 (P均 <0 .0 1)。乳腺癌组织中 h TR的表达与肿瘤分期相关 (P<0 .0 5 ) ,与病理类型、淋巴结转移、肿瘤大小无相关性 (P均 >0 .0 5 )。认为端粒酶基因h

反义寡核苷酸对胆囊癌细胞端粒酶活性的作用

目的:探讨反义寡核苷酸对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对胆囊癌细胞生长增殖的作用。方法:设计针对端粒酶 R N A 亚基模板序列并经硫代磷酸修饰的反义、正义和随机序列寡核苷酸,并以正常人成纤维细胞作对照,观察其对人胆囊癌细胞(G B C鄄SD )端粒酶活性和细胞生长增殖的影响以及对正常人成纤维细胞的作用。结果:反义寡核苷酸可有效地抑制 G BC 鄄SD 的端粒酶活性,呈剂量依赖性,并明显地抑制 G B C鄄SD 的生长,对正常人成纤维细胞生长无明显作用。结论:硫代反义寡核苷酸对胆囊癌端粒酶活性有明显的抑制作用。

胆囊癌hTR反义RNA基因真核表达载体的构建

目的采用RT-PCR法,提取胆囊癌细胞内的端粒酶RNA(hTR)基因,并针对其序列设计反义RNA切割基因序列,并将其构建入真核表达载体pTriEx-4内。方法 根据hTRcDNA序列,设计引物,经RT-PCR法从体外培养的胆囊癌细胞内调取hTR模板区基因,根据其测序结果,合成反义RNA基因,与经相应酶切的真核表达载体连接,酶切鉴定重组体的正确性。结果经RT-PCR从细胞内调出68bp序列,与hTRcDNA比较,与模板区域碱基序列一致。反义RNA基因重组子经酶切鉴定序列正确。结论 RT-PCR法可调出胆囊癌hTR基因有效片段,成功构建了针对hTR模板区的反义RNA基因的真核表达载体,为胆囊癌的基因治疗奠定了良好的基础。

转染HCV核心基因后对人胆管癌细胞中hTERT mRNA表达的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒核心基因 (hepatitisCviruscoregene ,HCVC基因 )调控端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)基因表达在肝门部胆管癌发生中的作用。方法 将构建成功的HCVC基重组真核表达载体pcDNAHCV -C和空载体与绿色荧光蛋白基因共转染人胆管正常上皮细胞 (hu mannormalbiliaryepithelialcells ,BEC)和胆管癌细胞QBC939,RT -PCR和免疫组织化学方法分析转染后细胞内hTERTmRNA和蛋白的表达。结果 pcDNAHCV -C在BEC和QBC939细胞中的转染率为 16 %和 32 % ,转染HCVC基因的BEC组表达hTERTmRNA ,而转染空载体的BEC不表达hTERTmRNA ;表达HCVC蛋白QBC939中hTERTmRNA和蛋白的表达明显高于空载体组。结论 转染的HCVC基因可以上调hTERT基因的表达 。

端粒酶基因hTR在乳腺癌组织中的表达

目的研究端粒酶基因hTR在乳腺癌组织和乳腺纤维腺瘤中的表达及意义。方法应用原位杂交的方法检测端粒酶基因hTR在30例乳腺癌和25例乳腺纤维腺瘤中的表达。结果30例乳腺癌中hTR表达阳性率为90%,25例乳腺纤维腺瘤中为16%,乳腺癌组织中hTR的表达与乳腺纤维腺瘤比较差异有显著性(P<0.01)。乳腺癌组织中hTR的表达与肿瘤分型、淋巴结转移、肿瘤大小无相关性(P>0.05)。结论端粒酶基因hTR表达检测在乳腺癌诊断中有一定价值。

抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞作用前后的基因表达谱研究

目的研究抗癌活性肽对人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞作用前后的基因表达谱,筛选与抗癌活性肽作用相关的基因表达改变。方法将1152条人类全长基因的PCR产物按微矩阵排列点样于特殊处理的玻片上制备成表达谱芯片;按一步法抽提抗癌活性肽作用前后体外培养的胆囊癌细胞的RNA并纯化mRNA,通过逆转录用两种荧光Cy3-dUTP和Cy5-dUTP标记对照和实验组胆囊癌细胞cDNA,制成cDNA探针并与表达谱芯片杂交,用ScanArray4000扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,计算机分析判定差异表达的基因。结果在1152条基因中筛选出有差异表达的基因245条,其中上调的121条,下调的124条。结论利用本基因表达谱芯片可同时研究数以千计的基因表达水平,从而在基因水平上探讨抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞作用的机制。

反义人端粒酶RNA亚基对胆囊癌端粒酶活性及细胞生长的抑制作用

目的 探讨反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对胆囊癌细胞生长增殖的作用。方法 根据测定的胆囊癌人端粒酶RNA亚基 (hTR)基因的序列结果 ,并根据真核表达载体多克隆酶切位点的物理图谱 ,体外合成反义RNA及正义RNA的基因序列 ,并构建入 pTriEx 4真核表达载体 ,酶切鉴定正确后 ,采用脂质转染法导入胆囊癌细胞。TRAP法检测端粒酶活性 ,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况 ,电镜观察细胞微观形态变化。结果 实验组胆囊癌细胞的端粒酶活性较对照组明显减低 ,正义组、转染空载体及单纯脂质体转染的细胞端粒酶活性与未转染细胞比较则变化不明显。反义RNA基因作用后 ,G0 /G1期细胞比例明显增高 ,S期细胞比例明显降低。细胞的分裂、增殖受到明显抑制。反义RNA基因转化后 ,10d凋亡率为 11.10 %。 13d后凋亡率为 2 9.0 2 %。电镜下可见明显凋亡细胞。结论 反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性有明显的抑制作用 ;并抑制胆囊癌细胞的生长 ,促进细胞的凋亡 ;且克服了反义寡核苷酸作用时间短的缺点。

表没食子儿茶素没食子酸酯对肝癌细胞端粒酶逆转录酶和c-myc基因表达的调控作用

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)作用肝癌细胞时端粒酶活性的变化、端粒酶逆转录酶(TERT)及cmyc基因表达的改变,以探讨EGCG对肝癌细胞端粒酶活性的调控机制。方法用聚合酶链反应免疫酶联吸附试验(PCR-ELISA)测定肝癌细胞端粒酶活性,逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测肝癌细胞中人端粒酶逆转录酶(hTERT)和c-mycmRNA表达。结果在一定时间、一定剂量范围内,EGCG能抑制肝癌细胞端粒酶活性,随着浓度的增加和时间的延长,端粒酶活性逐渐下调;尤其当EGCG浓度超过50mg/L或作用时间超过36h时,端粒酶活性下调更明显,与对照组比较差异用统计学意义(P<0.01);EGCG能抑制肝癌细胞hTRETmRNA的表达,其下降趋势与端粒酶活性下降趋势基本一致,且下调幅度较端粒酶活性下降更明显,两者呈正相关(r=0.931,P<0.01);而EGCG对肝癌细胞cmycmRNA表达的抑制率比hTRETmRNA表达的抑制率更高,并且c-mycmRNA表达先受到抑制,与hTRETmRNA表达的抑制相关明显(r=0.907,P<0.01)。结论EGCG对c-myc的抑制作用可能导致hTERTmRNA的抑制并进一步下调端粒酶活性。

锤头型核酶特异性阻断雄激素受体表达对前列腺癌细胞生长的影响

目的 探讨核酶阻断雄激素受体 (AR )基因表达治疗前列腺癌的可能性。方法 在脂质体介导下 ,锤头型抗雄激素受体核酶表达载体转染前列腺癌细胞 ,采用逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测ARmRNA ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法检测细胞增殖活性 ,流式细胞仪 (FCM )检测细胞周期时相 ,原位末端转移酶标记法检测细胞凋亡。结果 核酶表达载体转染 1～ 5d后 ,前列腺癌细胞ARmRNA水平降低 32 .6 %～ 40 .7% (P <0 .0 5 ) ,细胞生长抑制率 18.2 8%～ 35 .34%(P <0 .0 5 ) ,细胞周期阻滞于G2 M期 ,诱导细胞凋亡 ,细胞凋亡比率增加 2 0 .70 % (P <0 .0 1)。结论 应用核酶特异性切割ARmRNA ,能有效阻断AR基因的表达 ,诱导前列腺癌细胞凋亡 ,有可能成为前列腺癌基因治疗的有效方法之一。