新疆阿克苏地区鸭源鸡杆菌的分离鉴定和生物学特性分析

为确定引起新疆维吾尔自治区阿克苏地区某鸡场蛋鸡产蛋量下降和死亡的原因,本试验对采集自该鸡场病鸡的组织进行细菌分离和培养,对分离菌株进行形态学观察、生化鉴定和16S rRNA序列鉴定,并进行药敏试验和动物回归试验。结果显示,从病鸡病料中分离获得1株革兰阴性杆菌;生化试验结果显示,该分离菌株能分解乳糖和果糖等,过氧化氢酶、甘露醇和氧化酶等反应呈阳性;16S rRNA基因核苷酸序列系统进化树分析显示,该分离菌株与鸭源鸡杆菌同源性>99.9%;药敏试验结果显示,该分离菌株对四环素、氯霉素和环丙沙星等10种抗菌药耐药;动物回归试验结果显示,23周龄开产母鸡经生殖道接种分离菌株后采食量减少、产蛋量下降,剖检主要表现为输卵管炎、卵泡充血和变形等生殖道病变,与自然发病鸡一致;同居雏鸡与人工感染雏鸡分别在同居第2天和人工感染后第4天,可从上颚裂中分离出鸭源鸡杆菌,注射高浓度分离菌株可致雏鸡死亡。结果表明,引起该鸡场蛋鸡产蛋量下降和死亡的病原为鸭源鸡杆菌。本试验结果为治疗和防控鸭源鸡杆菌提供借鉴,为鸭源鸡杆菌的进一步研究提供了参考材料。

蛋鸡群卡氏杆菌感染情况的初步研究

首次报道了我国鸡场中鸭卡氏杆菌的感染情况。利用流行病学、临床观察、病理剖检、微生物学、分子生物学及血清学等方法研究表明，所调查的12个鸡场均有卡氏杆菌感染，平均抗体阳性率为48．4％，发病期为26～101周龄，典型症状是产蛋下降，病鸡腹部下垂、着地，行走如企鹅状，触之有波动感。剖检变化主要为卵黄性腹膜炎、输卵管炎或输卵管囊肿。从病鸡的卵巢、输卵管、肝脏等分离的细菌经鉴定为鸭卡氏杆菌，药敏试验显示，所有菌株仅对头孢类、阿莫西林、氨苄西林、氟苯尼考等药物高度敏感，而对其余大多数抗生素均不敏感。同时也分离到大肠杆菌和沙门氏菌。结果提示：我国鸡群中的卡氏杆菌感染可能已相当普遍，有必要对其影响做出客观评价。

我国部分地区蛋鸡群鸭源鸡杆菌血清流行病学调查

为了解鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)在我国部分地区鸡群中的感染状况,本实验采用G.anatis微量凝集试验对我国河南、山东和山西等不同地区的1 314份鸡血清样品进行了G.anatis感染的血清流行病学调查,对G.anatis的感染率、感染品种、日龄等进行分析。结果表明:我国河南、山东和山西等地鸡群均存在G.anatis感染,其中G.anatis血清Ⅰ型抗体阳性率为11.95%,G.anatis血清Ⅱ型抗体阳性率为23.29%,G.anatis血清Ⅳ型抗体阳性率为9.82%。不同省份的鸡群感染G.anatis的血清阳性率存在一定差异,河南、山东和山西的血清阳性率分别为23.12%、25.27%和52.94%。对河南地区不同品种和日龄鸡的调查表明,均存在不同程度的感染,但血清阳性率有显著差异,表现为罗曼鸡的血清阳性率比海兰鸡高,开产前蛋鸡的血清阳性率低于开产后的血清阳性率。

鸭源鸡杆菌整合子及其与耐药性的相关性分析

为了解鸭源鸡杆菌的整合子及其与耐药性之间的关系,运用PCR方法检测鸭源鸡杆菌分离株携带1、2、3类整合子的情况,采用K-B法测定61株鸭源鸡杆菌对13种抗菌药的敏感性,并分析其整合子与耐药性的关联性。结果显示,所有参试菌株对克林霉素、诺氟沙星、链霉素有耐药性的菌株比例均不低于88.52%(54/61)。19株鸭源鸡杆菌携带1类整合子,阳性率为31.15%,且此类菌株的耐药种数均≥3;在耐药种数≥5的菌株中,整合子阳性菌的比例(78.95%)显著高于整合子阴性菌的比例(28.57%,P<0.01)。本试验首次研究了鸭源鸡杆菌中整合子的分布情况。参试菌株仅携带1类整合子,且普遍存在多重耐药性;1类整合子可能在鸭源鸡杆菌多重耐药性的形成中发挥一定作用。

豫陕两省14株鸡杆菌的gyrB、16S rRNA和rpoB基因序列比较分析

分析河南、陕西分离的14株鸡杆菌(Gallibacterium)之间的进化关系,及gyrB基因序列比较在该菌进化分析中的作用。PCR扩增鸡杆菌分离株的gyrB、16SrRNA和rpoB3个看家基因,PCR产物纯化后直接测序。将鸡杆菌分离株、国外参考株的3个看家基因序列进行比较分析,用Phylip 3.67软件构建进化树。结果表明,14株鸡杆菌与鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)模式株间的相似性为96.3%～98.0%(gyrB)、97.7%～99.6%(16SrRNA)和97.7%～99.0%(rpoB);14株鸡杆菌与鸡杆菌复合群1(Gallibacterium genomosp.1)参考株间的相似性为88.8%～89.9%(gyrB)、96.2%～97.5%(16SrRNA)和92.6%～93.6%(rpoB)。基于3个看家基因序列的进化分析,均显示14株鸡杆菌和鸭源鸡杆菌模式株形成单独的一个群。14株鸡杆菌分离株均属于鸭源鸡杆菌种;在3个看家基因位点,鸡杆菌河南株与陕西株之间、鸡杆菌输卵管炎病鸡分离株与健康鸡分离株之间均无明显遗传上的差异;gyrB基因序列分析可用于鸡杆菌分离株的种类鉴定,且对14株鸡杆菌与复合群1参考株的区别能力优于另外2个看家基因。

鸭源鸡杆菌ompW基因缺失菌株的构建及其药物敏感性分析

探索OmpW在鸭源鸡杆菌耐药性形成中的作用。运用M-IV培养基诱导鸭源鸡杆菌自然感受态细胞,用含有氯霉素抗性(Cmpr)筛选标记和同源臂的线性DNA打靶片段替换目的基因;以PCR、SDS-PAGE及Western blot鉴定阳性转化子ΔompW。通过微量稀释法测定12种抗菌药物对鸭源鸡杆菌亲本菌株RU和突变株ΔompW的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示:鸭源鸡杆菌阳性转化子缺失了ompW,成功构建了ompW缺失突变菌株ΔompW;相对于RU,土霉素和四环素对ΔompW的MIC值分别降低到1/8(16/128,P<0.01)和1/32(4/128,P<0.01),其他药物的MIC值无明显变化。本研究首次利用自然转化法构建了鸭源鸡杆菌ompW缺失菌株ΔompW;OmpW在鸭源鸡杆菌抗四环素类药物中发挥重要作用。

鸡卡氏杆菌的分子鉴定及其16S rRNA基因序列分析(英文)

2003年Christensen等将过去归为输卵管炎放线杆菌、禽溶血性巴氏杆菌及鸭巴氏杆菌的细菌归为巴氏杆菌科中的一个新属——卡氏杆菌属。卡氏杆菌主要引起产蛋母鸡发病，可以导致输卵管炎、卵巢炎、腹膜炎、败血症、心包炎、肝炎、肠炎和呼吸道疾病等。

鸡卡氏杆菌的PCR检测及自然病例的组织病理学观察

为研究鸡卡氏杆菌引起输卵管囊肿的病理学变化,对9例自然感染病例进行症状观察,病理剖检,并采集气管、肺脏、输卵管和卵巢组织,从组织中提取基因组DNA,采用卡氏杆菌属特异性引物,用PCR方法成功扩增出卡氏杆菌目的基因;经PCR鉴定的卡氏杆菌阳性病料经甲醛固定,梯度乙醇脱水,石蜡切片,HE染色,光镜观察。结果表明:呼吸道的病变主要在黏膜层,黏膜上皮细胞脱落,固有层内毛细血管充血,炎性细胞浸润;输卵管主要表现在膨大和子宫的黏膜层有大量炎性细胞浸润,且黏膜上皮分泌细胞的细胞核破裂。输卵管的病变可作为该病病理诊断的重要指征之一,为阐明该病的输卵管特征性病理变化及进一步探讨其发生机制奠定了基础。

鸡杆菌河南分离株的分子进化分析

【目的】确定鸡杆菌河南分离株的具体种属和进化地位。【方法】以9株鸡杆菌河南分离株为研究对象,根据GenBank上登录的相关序列,针对鸡杆菌3个管家基因rpoB、infB和atpD设计引物,并进行PCR扩增、克隆和序列测定分析;将9株鸡杆菌的3个管家基因部分核苷酸序列,与已知的鸡杆菌属和巴氏杆菌科其他属相关参考株的相应基因序列进行比较分析并构建进化树。【结果】扩增出rpoBi、nfB和atpD3个管家基因部分序列,长度分别为566,531和1 441 bp,将测序结果登陆到GenBank。鸡杆菌分离株间的同源性分别为98.3%~100%（rpoB）、90.5%~100%（infB）和98.3%~100%（atpD）;分离株与国外鸭源鸡杆菌分离株间的同源性分别为97.1%~98.5%（rpoB）8、5.2%~93.2%（infB）和98.3%~98.8%（atpD）;分离株与国外鸡杆菌属其他种的同源性分别为84.3%~86.8%（rpoB）,83.1%~86.7%（infB）;鸡杆菌分离株与巴氏杆菌科其他代表属的同源性分别为77.4%~79.3%（rpoB）、78.2%~79.7%（infB）和83.5%~84.1%（atpD）。遗传进化分析显示,9株鸡杆菌河南分离株与鸭源鸡杆菌处于同一大分支之中。【结论】9株鸡杆菌河南分离株均为鸭源鸡杆菌。

卡氏杆菌对磺胺甲噁唑及链霉素的耐药性与耐药基因关系的初步研究

根据GenBank中发表的巴氏杆菌质粒上的磺胺类药耐药基因SulⅡ和链霉素耐药基因StrA的序列设计2对引物,以临床分离的对磺胺甲噁唑和链霉素耐药的8株卡氏杆菌为模板,扩增SulⅡ基因和StrA基因,然后将纯化的PCR产物进行克隆并作核苷酸序列测定,把测得的克隆基因序列与巴氏杆菌科其它属细菌耐药质粒上存在的SulⅡ基因和StrA基因序列(AJ514834)进行比较,结果显示它们之间具有很高的同源性(≥99.6%)。试验结果表明,卡氏杆菌的质粒上存在耐药基因SulⅡ和StrA,其对磺胺甲噁唑和链霉素的耐药性可能与SulⅡ基因和StrA基因的存在密切相关。

鸡输卵管囊肿病的病理学观察及相关病原的初步检测

为研究卡氏杆菌与鸡输卵管囊肿之间的关系,对42例自然发病鸡进行症状观察、病理剖检,并采取气管、肺脏、输卵管与卵巢组织块,经固定,脱水,石蜡切片,HE染色,光镜观察,利用PCR方法对上述组织进行卡氏杆菌检测,并对其病原混合感染进行了初步研究。结果表明,卡氏杆菌可以引起鸡呼吸道感染和生殖道损伤,显微镜下主要表现为呼吸道黏膜充血、肿胀,输卵管固有层腺体增多,卵巢中卵泡退化,呈空泡状;PCR方法对鸡群卡氏杆菌的阳性检出率为14%,组织阳性检出率为5.4%,且在被检组织中卡氏杆菌很少与其他病原体混合感染。

1株鸽源鸡杆菌复合群3的分离和鉴定

报道我国鸽场中鸡杆菌的感染情况.四川某种鸽场的种鸽出现以消瘦、呼吸困难、气管和肺出血、腹膜炎、输卵管炎等为主要特征的疾病.选取代表性病例,进行细菌分离和病毒检测,并对分离菌进行形态学观察、生化鉴定、动物试验、药敏试验和16S rRNA 基因序列分析.结果显示,部分病鸽只检测到新城疫病毒；从肝、肺中分离到1株革兰阴性短杆菌,命名为 SC01,该菌株为致病菌,小鼠半数致死量（LD50）为1.26＆#215;109 CFU/mL,能发酵多数糖和醇类,对头孢类药物较敏感.将 SC01与 GenBank 中同源性较近的15株细菌的16S rRNA 基因序列进行同源性分析,发现 SC01株与4株鸡杆菌复合群3（Gallibacterium genomo sp.3）的同源性为98.5%~99.5%,其中与EU423996的同源性最高,为99.5%,证实该菌株为鸡杆菌复合群3.试验结果为鸡杆菌复合群3感染的流行病学调查、诊断与治疗提供了新的参考.

河北省鸡群鸭源鸡杆菌血清流行病学调查

为了解鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)在河北省鸡群中的感染状况,采用乳胶凝集试验对河北省10个不同地市的677份鸡血清样品进行了鸭源鸡杆菌的血清流行病学调查,对鸭源鸡杆菌的感染率进行分析。结果表明:河北省不同地区鸡群均存在鸭源鸡杆菌感染,平均阳性率为48.60%,其中血清Ⅰ型抗体阳性率为29.54%,血清Ⅱ型抗体阳性率为29.69%,血清Ⅳ型抗体阳性率为22.16%。不同地市的鸡群血清阳性率存在一定差异,其中张家口和石家庄的鸭源鸡杆菌血清阳性率较高,分别为72.73%和80.95%。

鸭源鸡杆菌双重PCR检测方法的初步建立

为建立鸭源鸡杆菌(G.anatis)双重PCR检测方法,并对鸡杆菌分离株进行种类鉴定,本研究根据GenBank中G.anatis 12656-12株的gtxA基因序列设计一对PCR引物,合成扩增rpoB基因的引物作为内参基因,建立了G.anatis双重PCR检测方法。检测结果显示:以G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG株DNA为模板进行的双重PCR检测能够扩增出两条目的片段;其它16株细菌包括副鸡禽杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、福氏志贺菌和奇异变形杆菌均只扩增出了一条目的片段;该方法可以检测到浓度为6.5×102cfu/mL的G.anatis;34株鸡杆菌分离株均扩增出了两条预期大小的目的片段。此外,序列分析结果表明,10株鸡杆菌河南分离株的rpoB基因序列与鸭源鸡杆菌种参考株(CCUG 15563)的同源性最高(97.5%～99.0%),属于鸭源鸡杆菌种。本研究建立的G.anatis双重PCR检测方法,可用于含gtxA基因鸡杆菌菌株的鉴定及临床病原学诊断。

与鸡传染性支气管炎病毒混合感染状况下鸭源鸡杆菌在鸡体内的分布

为研究鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)在鸡体内的动态分布及鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)对其的影响,将鸭源鸡杆菌和鸡传染性支气管炎病毒分别或同时人工接种SPF蛋鸡,分别于接种后12、24、48、72、96h对鸡进行剖检,无菌采集鸡的10种组织样品(上腭裂、气管、肺脏、心脏、脾脏、卵巢、肾脏、肝脏、十二指肠和输卵管),利用SYBR Green I定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)方法检测鸭源鸡杆菌组、混合感染组在不同时间点、不同器官中的鸭源鸡杆菌DNA含量。结果显示:鸭源鸡杆菌单独感染时,12h时即可侵袭到气管、心脏、脾脏、卵巢和肾脏,24h时便可感染肝脏、十二指肠和输卵管,48h时可传播到肺脏,72h时感染上腭裂。混合感染组结果表明,鸭源鸡杆菌12h到达卵巢,24h时即可出现在所有器官。混合感染组各器官的总体qPCR检出率为37.1%,显著高于鸭源鸡杆菌组的25.3%。鸭源鸡杆菌组和混合感染组qPCR检测结果均显示,鸭源鸡杆菌DNA在气管中的检出率最高,在卵巢中达到最高含量。鸭源鸡杆菌能够造成试验鸡的全身感染,该菌主要对鸡的呼吸系统和生殖系统有致病性,气管和卵巢是其主要的致病器官;2种病原同时接种加重了全身感染,IBV促进了鸭源鸡杆菌在鸡体内的传播,尤其促进了其在十二指肠中的增殖,增强了鸭源鸡杆菌对消化系统的致病性,导致鸡腹泻的发生。

河南部分地区乌鸡群鸭源鸡杆菌的分离鉴定及系统发育分析

为了解乌鸡中鸡杆菌的流行情况及其分离株的遗传进化特点,从河南信阳和南阳的两个乌鸡场采集棉拭子样品,进行鸡杆菌的分离和荧光定量PCR检测,对分离的菌株进行PCR鉴定、药敏试验和16SrRNA、rpoB及gyrB基因的PCR扩增,随后进行三个管家基因的序列测定分析,利用DNAStar中MegAlign程序计算分离株之间的相似性,利用MEGA5.0构建进化树进行遗传进化分析。结果显示:22只乌鸡中16只为鸭源鸡杆菌阳性,阳性率为72.7%;分离的4株鸡杆菌经鉴定均为鸭源鸡杆菌;4株鸭源鸡杆菌均为多重耐药菌株,只对头孢曲松、头孢噻肟、阿米卡星和妥布霉素等药物具有一定的敏感性;分离株与鸭源鸡杆菌的参考菌株相似性分别为99.1%～99.8%(16SrRNA)、85.4%～99.6%(rpoB)、92.7%～99.8%(gyrB);在16SrRNA基因进化树中分离的4株鸭源鸡杆菌与参考鸭源鸡杆菌位于同一分支,在rpoB基因进化树中GAC193分离株与多杀性巴氏杆菌位于同一分支中,与其他鸭源鸡杆菌不在同一分支中,gyrB基因进化树中,GAC017与鸡杆菌基因种1在一个小的分支。结果表明:乌鸡中有鸭源鸡杆菌存在,并具有较高的检出率;从乌鸡中分离到4株鸭源鸡杆菌,这些菌株多重耐药现象严重;分离的部分鸭源鸡杆菌在rpoB和gyrB基因位点具有明显的遗传进化差异。

鸭源鸡杆菌对SPF雏鸡的感染特性研究

为研究鸭源鸡杆菌的流行病学特性,本研究采用从自然病例分离得到的鸭源鸡杆菌人工感染4日龄SPF雏鸡,通过形态学、PCR、荧光定量PCR和组织学等方法分别对感染后SPF雏鸡的组织脏器进行了细菌分离、检测和鉴定,用ELISA对其血清抗体水平进行检测。结果表明,人工感染鸡无临床症状,组织学检查感染鸡的肝脏、气管和肺脏组织均有损伤。人工感染后第3 d和同居感染第2 d鸡体内可分离出鸭源鸡杆菌,人工感染后第96 d仍能够分离到鸡杆菌。ELISA方法证实人工感染后47 d和同居后32 d出现抗体高峰,持续2～3周,人工感染组和同居组抗体水平均高于对照组(p<0.05);荧光定量PCR检测病料结果显示人工感染组和同居组的气管组织中细菌含量最高。本研究表明雏鸡在4日龄即可感染鸭源鸡杆菌,并能通过同居传播,长期带菌、排菌;感染后抗体产生缓慢、持续期短。本研究为鸭源鸡杆菌的流行病学、致病机理研究及防治措施的制定等提供了参考依据。

鸭源鸡杆菌外膜蛋白A基因克隆及结构与功能分析

为筛选鸭源鸡杆菌(G.anatis)潜在的保护性抗原基因,参考Gen Bank中G.anatis UMN179的外膜蛋白A(OmpA)基因序列设计1对引物,对鸭源鸡杆菌PDS-RZ-1-SLG(RZ)株的OmpA基因进行克隆,并应用相关软件对其核苷酸及氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,OmpA基因大小为1 083 bp,编码360个氨基酸;鸭源鸡杆菌RZ株的OmpA与UMN179、F149及12656/12的OmpA氨基酸相似性分别为93.2%、95.2%、92.7%;OmpA蛋白分子质量为38.4 ku,等电点为6.77,具有稳定性,N端有1个疏水性的α螺旋信号肽。

鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因扩增及序列分析

为了解不同鸭源鸡杆菌菌株外膜蛋白W基因(ompW)的差异性,对不同地域32株鸭源鸡杆菌ompW基因进行扩增、测序,并应用DNAstar/MegAlign和MEGA.5.05软件对其进行比对及遗传进化分析。结果表明:ompW基因存在于所有检测的鸭源鸡杆菌中。全长在630~711bp,编码209~236个氨基酸。与参考株UMN179的ompW核苷酸同源性为88.7%~100%,氨基酸同源性为86.7%~99.6%。不同来源的鸭源鸡杆菌的核苷酸同源率为84.1%~100%,氨基酸同源性为78.7%~99.6%。进化树分析表明,鸭源鸡杆菌ompW序列差异与分离地理位置,毒力无明显的相关性。

鸡卡氏杆菌的分离与16S rRNA基因的分析鉴定

四川雅安某种鸡场种鸡出现消瘦,腹部膨大,肝脏肿大破裂出血,腹膜和输卵管炎为主要特征的疾病。为诊断和预防此病的发生,通过对细菌分离纯化、形态学观察、生化试验、药物敏感性试验鉴定出1株致病菌,应用通用引物对细菌的16SrRNA基因进行克隆和测序,测序结果于NCBI上进行BLAST比对,选择同源性较高的巴氏杆菌科15个属的29株细菌16SrRNA序列进行比对分析,构建遗传进化树。结果表明,分离纯化的细菌能在血平板上生长,革兰氏染色阴性短杆状,能发酵大多数糖和醇类,对头孢类抗生素敏感,16S rRNA序列与卡氏杆菌属细菌的同源性最高,在92.2%～99.5%之间,特别是与鸭卡氏杆菌同源在97.5%～99.5%之间。遗传进化树分析结果表明,该菌株与卡氏杆菌属细菌属于同一大分类群,与鸭卡氏杆菌位于同一个小分支,最终诊断该鸡场为卡氏杆菌感染。