Gap-PCR与反向斑点杂交技术检测α-地中海贫血

目的探讨Gap-PCR与反向斑点杂交技术在α-地中海贫血中的应用价值。方法采用PCR(即Gap-PCR)技术检测缺失型α-地中海贫血;用反向斑点杂交技术检测非缺失型α-地中海贫血。结果在3 896份标本中共检出237例α地贫,阳性检出率为6.08%;通过Gap-PCR技术检测出56例α缺失型地贫,基因型分别为东南亚缺失型(--^(SEA)、右侧缺失型(-α^(3.7)和左侧缺失型(-α^(4.2));4例HbH型;通过反向斑点杂交技术检测出8例非缺失型α地贫,基因型分别为αα/α^(QS)和αα/α^(WS)。结论α-地中海贫血是我国南方影响最大的常见遗传病之一,应加强对地中海贫血的血液学筛查和基因诊断,提高诊断符合率。

优化易错PCR条件以提高毕赤酵母GAP启动子文库突变效率

高效的随机突变策略对于构建含有丰富突变体的启动子文库至关重要。为了建立一个突变率适中并能获得较多有益突变子的易错PCR(error-prone PCR,EP-PCR)条件,实现毕赤酵母GAP启动子的高效突变,对EP-PCR反应条件进行了优化。考察了模板浓度、反应循环数和Mg2+浓度对EP-PCR的产物得率和突变率的影响后,确定了适于GAP启动子突变的EP-PCR条件:模板浓度、反应循环数和Mg2+浓度分别为1 ng/μL、25和10 mmol/L。优化EP-PCR条件后,GAP启动子突变率为1.1%,连续进行3轮EP-PCR后突变率可达到4.0%。利用优化后EP-PCR对GAP启动子进行随机突变,筛选了250个突变子,获得5个启动子强度高于野生型GAP启动子的突变体,有益突变达到了2%,可用于构建GAP启动子文库。

GAP-PCR技术快速对α-地贫血基因诊断方法的研究

目的 :建立跨越断裂点的PCR技术 (也称裂口PCR、gap -PCR)为α -地贫血基因诊断提供良好的方法。方法 :应用 gap -PCR技术对 382例病人进行α -地贫血基因诊断。扩增产物带出现 10 5 3bpDNA片段时表示为α类珠蛋白基因型 (αα/αα) ,出现 743bpDNA片段增带时表示为缺失型HbH病 (α - / - - SEA) ,若样品为胎儿则为Barts水肿综合症 (- - SEA/ - - SEA) ,同时出现 10 5 3bp和 743bp两个DNA片段的扩增带表示为α -地贫杂合子 (- - SEA/αα)。结果 :382例人中 ,32 5例为正常基因型 (αα/αα) ,49例为α -地贫杂合子 (- - SEA/αα) ,8例为缺血失型HbH病 (α - / - - SEA)。结论 :gap -PCR技术应用于α -地中海贫血的血液学筛查具有简便、快速、准确的特点 。

神经再生素对背根神经节细胞GAP-43和NF-L基因表达的影响

目的 :观察中药有效组分神经再生素作用于神经细胞生长过程中 ,相关基因的表达变化 ,探讨神经再生素促神经生长的分子生物学机制。方法 :采用RT PCR法 ,观察神经再生素在促大鼠背根神经节生长过程中(4h、12h、2 4h) ,生长相关蛋白 43(GAP 43)和神经丝蛋白 (NF L)基因表达的变化。结果 :神经再生素可使背根神经节细胞GAP 43和NF LmRNA的表达量增加。结论 :神经再生素可作用于体外培养的神经细胞 。

TaqMan实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数

以3-磷酸甘油醛脱氢酶为内参基因,建立一种快速检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的TaqMan荧光定量PCR方法。通过对反应参数进行优化,建立针对目的基因和内参基因的双标准曲线,并对重组酵母基因组中外源基因和内参基因的拷贝数进行同时定量检测,外源基因与内参基因起始模板拷贝数的比值即为外源基因在重组酵母菌株基因组中的拷贝数。结果表明,2条标准曲线在101～108拷贝.μL-1具有良好的线性关系,以及良好的敏感性和重复性。利用该方法对60株重组酵母菌株进行荧光定量PCR检测,结果筛选到38株单拷贝插入菌株和22株多拷贝插入菌株。本研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR方法方便、高效,可用于重组毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的检测。

引物间同源性和裂口对PCR扩增的影响

采用 PC/ Gene软件对能扩增出特异带和不能扩增的 PCR引物进行同源性比较 ,同源间“裂口 ( gaps)”差数的统计 ,得出同源率小于或等于 35% ,“裂口”差数大于或等于 3,是获得理想 PCR扩增效果的关键参数之一的结论 。

跨跃断裂位点PCR检测α-珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失及其临床应用

目的评价跨跃断裂位点PCR(GAP-PCR)法检测α-珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失(-α3.7,-α4.2,-SEA)的可行性,并进行初步临床应用。方法用GAP-PCR法检测158例临床疑诊为α-珠蛋白生成障碍性贫血病人血标本,用金标准Southern blot法进行盲法平行检测,评价前者方法学性能。结果GAP-PCR法检出α-珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失阳性率为42.41%(67/158),其中αα/--SEA为32.91%(52/158),-α3.7/αα为6.96%(11/158),-α4.2/αα为1.90%(3/158),-α3.7/--SEA为0.63%(1/158),与Southern blot法完全一致。GAP-PCR法检测敏感度、特异度和准确度均为100%。结论此法检测结果准确,操作简便,为α-珠蛋白生成障碍性贫血诊断和筛查的有效方法。

跨越断裂位点PCR检测α-地中海贫血基因缺失

目的:运用跨越断裂位点PCR(GAP-PCR)法检测α-地中海贫血(α-Thal)基因缺失类型,评价临床应用的可行性。方法:对213例临床疑诊为α-Thal患者血液标本进行GAP-PCR法检测。结果:α-Thal基因缺失阳性率为42.34%(90/213),其中--SEA为32.39%,-α3.7为7%,-α4.2为1.88%,GAP-PCR法检测敏感度、特异度和准确度均为100%。结论:GAP-PCR检测α-Thal基因缺失类型结果准确,操作简便,为诊断和筛查α-Thal的有效方法。

大鼠视网膜发育过程中GAP-43表达的差异性

目的:研究GAP-43在正常大鼠视网膜发育过程中差异表达。方法:采用RT-PCR方法检测正常大鼠生后不同时期视网膜发育过程中GAP-43 mRNA水平的表达差异;通过免疫组化检测其蛋白水平的表达差异,并对实验结果进行统计分析。结果:大鼠视网膜GAP-43 mRNA表达量在生后逐渐升高,在P21表达量最多,之后逐渐下降,到成年时维持在一个较低水平。各组差异有统计学意义(P<0.01)。结论:正常大鼠视网膜发育过程中GAP-43 mRNA及GAP-43蛋白水平的表达在生后逐渐升高,之后逐渐下降。

TEC间距对PCR仪温度均匀性影响的有限元研究

半导体制冷片(TEC)的布置间距是影响聚合酶链式反应(PCR)仪温度均匀性的重要因素之一。本文分析了PCR仪热循环系统的基本结构及传热原理,针对某型号PCR仪构建了三维传热模型,并运用数值仿真方法研究了TEC布置间距对PCR仪温度均匀性的影响规律。结果表明,TEC的布置间距越大,PCR反应试液的温度均匀性越好。

荒漠昆虫小胸鳖甲Ras GTP酶激活蛋白基因MpRasGAP的克隆及低温表达分析

【目的】丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)级联是细胞的重要信息传递系统之一,Ras GTP酶激活蛋白(Ras GTPase-activating protein,Ras GAP)基因Ras GAP和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun Nterminal kinase,JNK)基因JNK分别是MAPK信号转导途径的上、下游基因。本研究旨在确定荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis Ras GAP及JNK基因对低温的响应情况。【方法】从荒漠甲虫小胸鳖甲中克隆获得Ras GAP基因的c DNA序列,利用生物信息学分析软件分析其氨基酸序列并构建进化树,利用实时荧光定量PCR检测低温胁迫条件下Ras GAP和JNK基因的表达情况。【结果】小胸鳖甲Ras GAP c DNA的开放阅读框2 523 bp,命名为MpRas GAP(Gen Bank登录号:KM677930),编码840个氨基酸,分子量96.594 k Da,编码蛋白MpRas GAP属于Ras GAP超家族。MpRas GAP与赤拟谷盗Tribolium castaneum Ras GAP的氨基酸序列一致性达89%。小胸鳖甲在4℃和-4℃低温胁迫1 h后,MpRas GAP的mRNA水平都显著高于室温对照(25℃)。小胸鳖甲在4℃处理3 h或-4℃处理1 h后,Mp JNK的mRNA水平也显著升高。【结论】本研究结果表明小胸鳖甲MpRas GAP和Mp JNK的mRNA水平受低温诱导。研究结果有助于深入研究荒漠昆虫在低温下MAPK信号转导途径的作用机制。

四川南充地区1056例地中海贫血初筛阳性样本的基因诊断结果分析

目的:了解四川南充地区人群α、β-地中海贫血的基因类型及分布特征。方法:选取南充市中心医院2015年7月至2017年7月就诊的MCV、MCH异常(MCV<80 fl和或MCH<27 pg),且已排除缺铁性贫血和其他贫血性疾病的疑似地中海贫血患者,采集EDTA抗凝静脉血3 m L,采用国际先进的多聚酶链扩增(GAP-PCR)技术和DNA芯片反向斑点杂交检测技术进行α、β-地中海贫血基因检测,包括α-地贫的3种缺失型(--SEA/αα、-α4.2/αα、-α3.7/αα、)、3种突变型(-ααCS/αα、-ααQS/αα、-ααWS/αα)及β-地贫的17种突变位点。结果:1 056例样本中共检出α、β-地贫330例,检出率为31.3%。其中,α-地贫168例(15.9%),β-地贫161例(15.3%),αβ复合突变1例(0.1%)。在330例确诊地贫样本中,α-地贫168例,构成比50.9%,有6种亚型:--SEA/αα、-α4.2/αα、-α3.7/αα、-ααCS/αα、-ααQS/αα、--SEA/-α3.7,以--SEA/αα(72.6%)、-α3.7/αα(17.9%)为主,占α-地贫的90.5%;β-地贫161例,构成比8.8%,有6种类型:CD17、CD41-42、-28、-29、IVS-II 654、CD41-42/-29,其中最常见的3种突变类型为:CD17(50.3%)、CD41-42(31.1%)及IVS-II 654(14.3%),占β-地贫的95.7%;α复合β-地贫1例(0.3%),基因型为-α3.7/αα复合βIVS-II-654M。1 056例受检者中,男性369例,检出地贫90例(24.4%),女性687例,检出地贫240例(34.9%),女性地贫基因检出率明显高于男性,差异具有统计学意义(χ2=12.423,P=0.001)。结论:四川南充地区是地中海贫血高发地区之一,α-地贫最常见的基因型为--SEA/aa,β-地贫以17M突变型最常见。

广东地区中国型~Gγ^+(~Aγ δ β)~0地中海贫血的基因鉴定及分析

目的对22例中国型Gγ^+(Aγδβ)0地中海贫血进行基因检测,分析临床特征并探讨其检测意义。方法分析血液学参数、血红蛋白电泳结果及常规α地贫基因和β地贫基因检测结果等,找到126例疑似中国型Gγ^+(Aγδβ)0地贫携带者,利用gap-PCR检测中国型Gγ^+(Aγδβ)0地贫基因。结果126例疑似地贫携带者中检测出20例中国型Gγ^+(Aγδβ)0地贫携带者,其胎儿血红蛋白(HbF)为7.31%~19.31%,血红蛋白(Hb)为94~141g/L、红细胞平均体积(MCV)为58~77.6fL、红细胞平均血红蛋白(MCH)为18.2~25.7pg。另检测到2例患者为中国型Gγ+(Aγδβ)0地贫合并其他常见β地贫,其在临床上表现为中重型地贫。结论在HbF(>2.5%)偏高的人群中,中国型Gγ^+(Aγδβ)0地贫检出比例不低,其中国型Gγ^+(Aγδβ)0地贫杂合子表现为无贫血或者轻度贫血症状,而中国型Gγ^+(Aγδβ)0地贫合并其他β地贫时则表现为中重型贫血,临床应注意进行产前诊断以降低此类患儿比率。

广州地区疑诊地中海贫血患儿α-地中海贫血基因突变型研究

目的了解广州地区高风险儿童α-地中海贫血(α-地贫)的发病率和3种主要的基因型分布情况。方法应用单管四重Gap-PCR法对广州地区高风险地贫儿童5 099例进行α-地贫基因分析。结果共检出α-地贫患儿1 792例,总检出率为35.14%。其中--SEA/αα1326例(26%),-α3.7/αα179例(3.51%),-α3.7/-α3.75例(0.10%),-α4.2/αα60例(1.18%),-α4.2/-α4.22例(0.04%),-α3.7/-α4.23例(0.06%),-α3.7/--SEA151例(2.96%),-α4.2/--SEA66例(1.29%)。患儿的基因构成比分别为1543例携带--SEA,占76.42%;343例携带-α3.7,占16.99%;133例携带-α4.2,占6.59%。--SEA为主导缺失型。结论广州地区高风险儿童具有高α-地贫发病率和携带率,--SEA是主要的α-地贫缺失型,是重症α-地贫和HbH致病的主要风险因素。

利用NGS技术同时检测缺失和点突变型地中海贫血

目的建立一种跨越断裂点PCR(Gap-PCR)结合下一代测序技术的地中海贫血基因检测方法。方法对地中海贫血核酸国家参考品进行PCR扩增,PCR产物进行高通量测序。结果 32例国家参考品涉及的3种α突变型别,16种β突变型别,4种α缺失型别,2种β缺失型别全部检出,均与原型别一致。结论本研究通过建立基于Gap-PCR结合下一代测序技术检测地贫的方法进一步完善了遗传病基因诊断方法,对遗传病的携带人群筛查,优生优育咨询,防止出生缺陷等方面具有重要意义。

林窗对凋落物分解过程中细菌群落结构和多样性的影响

基于细菌16S rDNA 的PCR-DGGE 方法,以林下（US）为对照,研究了长江上游低山丘陵区人为采伐形成的马尾松（Pinus massoniana）人工林7 种不同大小林窗（G1：100 m^2、G2：225 m^2、G3：400 m^2、G4：625 m^2、G5：900 m^2、G6：1 225 m^2、G7：1 600 m^2）在冬夏两季对凋落物分解过程中细菌群落结构和多样性的影响.结果表明,凋落物中的细菌群落结构和多样性受到林窗大小的显著影响,这种差异性受到季节的影响.有些菌纲只出现在特定大小的林窗,例如,绿弯菌纲（Chloroflexi）和放线菌纲（Actinobacteria）都只出现在US 和G1 林窗,芽孢杆菌纲（Bacilli）只出现在大中型（G4-G7）林窗,黄杆菌纲（Flavobacteria）只出现在中型（G4 和G5）林窗,浮霉菌纲（Planctomycetacia）只存在于G5、G7 和US.冬夏两季细菌群落结构差异较大,冬季的细菌类群高于夏季.在冬季,细菌群落的多样性与林窗大小、凋落物含水率、日平均温度、凋落物的全碳、可溶性有机碳和全氮含量显著相关;在夏季,细菌群落的多样性仅与日平均温度和全碳含量显著相关.总体来看,变形菌门是凋落物分解过程中的优势类群,有利于凋落物分解过程中的碳氮循环.林窗的形成改变了凋落物中的细菌群落结构和组成,减小了凋落物分解过程中细菌群落的丰富度指数、多样性指数和均匀度指数,但增大了优势度指数.冬季的细菌群落的丰富度、多样性和均匀度高于夏季,优势度则低于夏季.

Ⅰ型神经纤维瘤病基因GRD区突变研究

目的 对39例Ⅰ型神经纤维瘤病（NF1）患者基因的部分GTP酶活化蛋白相关功能区（GRD区）的cDNA突变进行研究。方法 应用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分段扩增GRD区域上的cDNA序列,用单链构象多态性（SSCP）及直接测序法对RT-PCR产物进行突变分析。结果 仅发现1例点突变G3918T颠换,导致1306精氨酸（R）变成亮氨酸（L）。结论NF1基因的GRD区可能不是NF1基因突变的热点区域。

CON43蛋白及mRNA在子宫内膜异位症中表达及意义

目的:探讨间隙连接蛋白CON4 3mRNA及蛋白在子宫内膜异位症中的表达及意义。方法:对2 0例子宫内膜异位症内膜用免疫组化法检测CON4 3蛋白的表达,用RT -PCR检测其mRNA表达,并与2 1例其他良性疾病子宫的内膜进行比较。结果:CON4 3蛋白主要在内膜腺上皮细胞浆中表达,内异症组中CON4 3蛋白表达较对照组显著降低;且内异症组中CON4 3mRNA较对照组显著降低。结论:子宫内膜异位症中间隙连接蛋白CON4 3在mRNA水平和蛋白水平较对照组显著降低,可能是导致内膜上皮细胞间的物质和信号传递减低或缺失,内膜细胞在它处游走。

一种新的3.8kb缺失α地贫基因的鉴定

目的首次报道一种新的3.8 kb缺失α地贫基因,利用gap-PCR技术建立该缺失片段检测方法。方法采集先证者及其母亲外周血,进行血液学参数常规地贫基因检测,对常规基因检测结果存在疑问标本重新设计新gap-PCR引物及体系以测试发现证实新的缺失α地贫基因类型。结果先证者检出新的α珠蛋白基因缺失,缺失片段大小为3814 bp,确认先证者α地贫基因型为-α4.2/-α3.8,其母亲基因型为αα/-α3.8。结论本研究首例报告了一种新发现的3.8 kb缺失α地贫基因,丰富了世界地中海贫血突变基因数据库,特异性gap-PCR的建立为该类型地贫基因检出提供方便、有效的检测手段。

牛膝多肽促大鼠海马神经元突起的生长

目的研究牛膝多肽(ABPP)对体外培养的大鼠海马神经元突起生长的促进作用及其对生长相关蛋-白43(GAP-43)和神经丝蛋白(NF-H)mRNA和蛋白表达的影响。方法以体外原代培养的胎鼠海马神经元为研究模型,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)检测ABPP对海马神经元细胞活性的影响,通过免疫荧光细胞化学法,采用Image-Pro Express软件测量不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药24h,对海马神经元神经突起生长的影响;通过实时荧光定量PCR法定量分析不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药6h,对海马神经元GAP-43和NF-H基因表达的影响;采用免疫印迹法观察不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药24h后,对海马神经元GAP-43和NF-H蛋白表达的影响。同时应用胞外信号调节激酶(ERK)特异性拮抗剂PD98059与ABPP共培养海马神经元,分析ABPP对海马神经元的作用与ERK通路的关系。结果ABPP可有效地促进海马神经元突起的生长,加药后24h浓度为1.0mg/L,作用最强;实时荧光定量RT-PCR、免疫荧光细胞化学法和免疫印迹检测的结果表明,ABPP能增加体外培养的海马神经元GAP-43和NF-H的mRNA和蛋白表达,PD98059可抑制该过程。结论ABPP能促进体外培养的海马神经元神经突起的生长,其作用与上调GAP-43和NF-H基因的表达相关,并可能与ERK通路有关。