Gap-PCR与反向斑点杂交技术检测α-地中海贫血

目的探讨Gap-PCR与反向斑点杂交技术在α-地中海贫血中的应用价值。方法采用PCR(即Gap-PCR)技术检测缺失型α-地中海贫血;用反向斑点杂交技术检测非缺失型α-地中海贫血。结果在3 896份标本中共检出237例α地贫,阳性检出率为6.08%;通过Gap-PCR技术检测出56例α缺失型地贫,基因型分别为东南亚缺失型(--^(SEA)、右侧缺失型(-α^(3.7)和左侧缺失型(-α^(4.2));4例HbH型;通过反向斑点杂交技术检测出8例非缺失型α地贫,基因型分别为αα/α^(QS)和αα/α^(WS)。结论α-地中海贫血是我国南方影响最大的常见遗传病之一,应加强对地中海贫血的血液学筛查和基因诊断,提高诊断符合率。

PCR-反向点杂交法在HPV分型中的临床应用

分析HPV分型中应用PCR-反向点杂交法的实际效果。方法 将本院2020年8月至2022年11月2940例应用PCR-反向点杂交法检测HPV分型的门诊、住院患者作为研究对象,对数据进行统计,分析HPV分型分布情况。结果 2940例女性经PCR-反向点杂交法检出HPV阳性501例(检出率:17.04%)、HPV单型阳性377例(检出率:12.82%)、HPV2型以上阳性124例(检出率(4.22%)、纯低危型阳性54例(检出率1.84%)、高危型阳性447例(检出率:12.50%)、高危型在HPV阳性中占比89.22%;HPV高危型阳性分布情况中以HPV-52(141/2940,4.80%)、HPV-51(58/2940,1.97%)、HPV-53(56/2940,1.90%)、HPV-16(54/2940,1.83%)、HPV-58(50/2940,1.70%)阳性率相对较高;2940例女性中HPV阳性占比最高的是31-40岁年龄段(占比率达34.33%),21-50岁是HPV阳性的高危人群,总共占比率高达79.24%。结论 通过HPV分型检测,可确定HPV感染的型别、区分单一感染与多重感染、区分持续感染与一过性感染患,对于预防宫颈癌变、提高预后效果有重要意义;PCR-反向点杂交法在确定HPV分型中具有极高的应用价值,可依据受检者感染的基因类别,明确受检者感染风险,进行进一步检查、复查,对持续高危型感染者进行早期治疗,在预防宫颈癌中具有积极意义。

生物技术专业分子生物学实验的建立与思考——以反向点杂交检测β-地中海贫血基因类型为例

本校在面向应用型人才培养的生物技术专业中开设反向点杂交检测β-地中海贫血基因类型的实验项目。从生物安全与阳性基因型多样性的角度出发,实验室将CD41-42(-TTCT)、-28(A>G)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD71-72(+A)、CD17(A>T)以及野生型共6种常见的基因型克隆至T载体中,建立β-珠蛋白基因突变类型模板库,丰富实验内容。同时笔者对实践教学提出思路,首先,小教师+翻转课堂教学法充分激发学生学习探索的兴趣;其次,在课堂的实验等待时间组织讨论,充分结合理论与实验知识点,以提高教学效果;最后,思政教育与实践同行,培养科学逻辑思维与良好实验习惯,并鼓励科普宣教。

应用PCR-反向点杂交法检测β-地中海贫血基因点突变

目的对疑似β-地中海贫血的4例患者进行基因诊断。方法针对β-珠蛋白基因上17个位点突变,使用特异性带有生物素标记的引物进行PCR扩增,扩增产物与固定在膜条上的寡核苷酸探针进行杂交,并通过一系列显色反应,明确检测样品在17个位点是否发生了突变,以及是否为突变纯合子或杂合子。结果 1号和2号患者均为CD17M(A→T)/N,βEM(GAG→AAG)/N双重杂合子;D3号患者为IVS-Ⅱ-654M(C→T)/N杂合子;D4号患者为IVS-Ⅱ-654M/IVS-Ⅱ-654M(C→T)纯合子。结论利用PCR-反向点杂交法技术,能对β-地中海贫血患者进行基因诊断,对其产前诊断、临床治疗以及携带者检出具有重要意义。

反向点杂交法检测广东地区丙型肝炎病毒基因型和基因亚型

目的建立并应用HCV基因分型技术PCR-反向点杂交法(PCR-RDH),调查广东地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型和亚型的分布情况。方法应用生物信息学软件针对HCV5'端非编码区(5'UTR)和核心蛋白区(C区)设计特异性捕获探针及生物素标记引物,建立HCV基因分型的PCR-反向点杂交技术。应用本技术对115例慢性丙型肝炎患者血清标本进行HCV基因型和亚型检测,同时对其中38份标本中的HCV进行RT-PCR扩增、测序、系统进化树分析确定HCV基因型和亚型,以评价反向点杂交法的准确性及临床应用价值。结果 115份血清标本中,反向点杂交法HCV基因型及亚型检出率为96.5%(111/115),15份阴性对照全部为阴性。111例检出基因型的标本中1b型63例(56.8%)、2a型9例(8.1%)、3a型4例(3.6%)、3b型6例(5.4%)、6a型28例(25.2%)、1b/2a混合型1例(0.9%)。经测序分型确定此法检测准确度为100%,特异度为100%。结论 HCV基因型反向点杂交法检测准确可靠、简便经济、高效,适用于临床检测。广东地区的HCV基因型分布以1b型为主,呈现出1b型比例下降,3a、6a型比例升高的趋势。

PCR-反向点杂交法在外阴阴道念珠菌病诊断及白念珠菌耐药基因突变检测中的应用

目的评价PCR-反向点杂交法用于念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测的应用价值。方法收集念珠菌性阴道炎患者及体检健康妇女分泌物各285份和50份。用生物梅里埃酵母菌鉴定卡进行菌种鉴定,用最低抑菌浓度(MIC)法(郑州安图真菌快速培养鉴定药敏试剂)进行药敏试验;采用PCR-反向点杂交法(深圳亚能念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测试剂)进行菌种鉴定和耐药基因突变检测;采用PCR及测序方法进行耐药基因的检测。分别以培养鉴定法、MIC法、核酸序列测定法为对比方法,评价PCR-反向点杂交法念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测的敏感性、特异性及准确性。结果与培养鉴定法相比,PCR-反向点杂交法检测6种念珠菌菌种的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和总符合率分别为95%、96%、96%、98%、97%以上,2种方法检测6种念珠菌(白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和季也蒙念珠菌)结果的差异无统计学意义(χ~2值分别为0.44、0、0、0、0和0,P均>0.05),一致性较好(Kappa均>0.9)。与MIC法相比,PCR-反向点杂交法检测白念珠菌耐药的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和总符合率分别为98%、88%、98%、88%和96%,2种方法检测结果的差异无统计学意义(χ~2=0.17,P>0.05),一致性较好(Kappa>0.8)。PCR-反向点杂交法与核酸序列测定法相比,对6种白念珠菌耐药基因突变位点的检测结果完全一致。结论PCR-反向点杂交法在念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测上与培养鉴定法以及核酸序列测定法的一致性高,比传统检测方法更早期更快速,可应用于外阴阴道念珠菌病(VVC)的辅助诊断。

多重聚合酶链反应和反向线性点杂交技术在常见呼吸道病毒检测中的应用

目的应用多重聚合酶链反应(mPCR)扩增基因技术和反向线性点杂交技术(RLB)相结合的方法从基因水平建立常见呼吸道病毒的检测方法。方法根据常见的7种呼吸道病毒包括流感病毒A,副流感病毒1、2、3型,腺病毒1型,呼吸道合胞病毒A、B型的特点设计特异性的引物和探针,应用mPCR/RLB技术对常见的7种病毒株进行检测,建立研究方法。结果使用特异性引物对7种病毒株的基因进行mPCR,均得到相应的目标扩增产物,扩增条带清晰,与目标片段一致。7种病毒株的PCR产物与特异性探针杂交,均可得到清晰的杂交模式,并且彼此之间没有交叉反应,与作为阳性对照的细菌标准菌株亦没有交叉反应。结论 mPCR和RLB相结合是从基因水平检测常见呼吸道病毒的方法 。

应用反向点杂交法检测α-地中海贫血点突变

目的建立一种临床上切实可行的非缺失型α-地中海贫血基因检测方法。方法中国人常见的非缺失α-地中海贫血为αCSα、αQSα、αWSα3种类型,针对此3个位点设计特异性带有生物素标记的引物进行PCR扩增,扩增产物与固定在膜条上的寡核苷酸探针进行杂交,并通过一系列显色反应分析结果。结果分别分析3种突变类型的正常及突变位点信号,明确检测样品在3个位点是否发生了突变,及是否为突变纯合子或杂合子,验证了该方法可诊断非缺失型!-地中海贫血点突变。结论该检测方法结果可靠,且简便易行,对实验室仪器设备要求不高,适合于在临床推广。

反向点杂交法在β-地中海贫血基因诊断中的应用

目的初步评价反向点杂交法对β-地中海贫血基因的诊断效能。方法使用反向点杂交法对1 004例疑似β-地中海贫血病例进行基因诊断。结果1 004例外周血样品中有283例β-地中海贫血。共发现11种突变,其中CD41-42(40．89％),IVS-2-654(22．68％),CD17(12．71％),TATAbox-28(14．43％),CD43 (3．78％)和CD26(1．72％),占突变的95％以上。结论反向点杂交法具有快速、准确的优点,适用于普通人群的β-地中海贫血分子检测和产前诊断。

多重PCR/反向线点杂交(RLB)检测细菌性脑膜炎病原体的研究

目的建立快速、高通量的多重PCR/反向线点杂交(RLB)的方法检测3种细菌性脑膜炎病原体--肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌。方法针对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌的特异性基因序列设计引物和相应的特异性探针,优化多重PCR/RLB检测中的引物浓度、dNTP浓度、探针的浓度等的条件。结果多重PCR/RLB检测对肺炎链球菌DNA最低检测极限可达6.2×10-1ng/μl,对流感嗜血杆菌DNA最低检测极限可达8.5×10-8ng/μl,对脑膜炎奈瑟菌DNA最低检测极限可达8.3×10-8ng/μl。结论多重PCR/RLB检测体系能够正确的鉴定3种细菌性脑膜炎病原体,用于临床样本的高通量筛查细菌性脑膜炎病原体,特异性好,灵敏度高。

改进反向点杂交方法检测脑肿瘤基因突变

目的 探讨利用改进的反向点杂交方法检测已知细胞因子及肿瘤相关基因在胶质瘤、听神经瘤及脉络丛乳头状瘤中表达及突变的可行性 .方法 分别提取正常脑组织和胶质瘤、听神经瘤、脉络丛乳头状瘤组织中的总 RNA,并反转录为 c DNA,随机引物法标记探针 ,与点于特殊尼龙膜上的已知分子进行反向杂交 .结果 该方法可同时检测多种基因在四种组织中的表达 ,其中 BMP- 6、GH,Sis,m dm 2在四种组织中均有较高水平表达 ,而 BMP- 7,IL- 1,- 11,- 12 ,TGF- α,G- CSF,TPO,Endostatin,nm2 3,raf,p5 3,c- er B2 ,ANG在四种组织中均为低表达 ;其余基因在四种组织中的表达水平有较大的差异 .结论 改进的反向点杂交方法可同时检测多种基因的表达 ,并在不同的组织间进行比较 。

PCR-反向点杂交法在结核杆菌耐药突变基因检测中的应用

目的了解深圳结核病患者结核杆菌耐药基因突变和耐药情况,评价PCR-反向点杂交法检测结核杆菌耐药基因突变的方法学性能。方法采用PCR-反向点杂交法检测264例(初治患者141例,复治患者123例)临床分离结核杆菌菌株或经抗酸染色镜检为阳性的痰标本中结核杆菌13个耐药基因突变位点。以DNA测序法为金标准,评价PCR-反向点杂交法检测结核杆菌耐药基因突变的方法学性能。结果 264例结核病患者对4种常用抗结核药物中1种或以上耐药者90例,耐药率34.09%,其中耐多药率19.32%。141例初治患者耐药率为17.73%,耐多药率为4.96%。123例复治患者耐药率为52.85%,耐多药率35.77%。对异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇的耐药率分别为22.73%、20.45%、15.91%和6.82%,相应最常见突变位点分别为315M、S531L、43M和306M2。突变位点检出率超过5%的为315M(28.74%)、43M(20.69%)、S531L(15.52%)、15M(8.62%)、306M2(6.90%)和H526Y(5.17%)。PCR-反向点杂交法检测结核杆菌耐药基因突变的敏感度为94.74%、特异度为100%、准确度为98.11%,Kappa值为0.958 4(95%CI:0.837 9～1.078 9)。结论深圳结核病患者对抗结核药物耐药率和耐多药率均较高,复治患者耐药率和耐多药率分别比初治患者高2倍和6倍,对异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇的耐药性依次降低,相应最常见耐药基因突变位点分别为315M、S531L、43M和306M2。PCR-反向点杂交法检测结核杆菌耐药基因突变的敏感度、特异度和准确度均能满足临床要求,适合临床实验室使用。

PCR-反向点杂交法检测乙型肝炎病毒的基因耐药变异与基因分型

目的探讨PCR-反向点杂交法用于检测HBV基因耐药变异与基因分型的可行性。方法采用PCR-反向点杂交法对89例慢性乙型肝炎患者的血清标本进行HBV基因耐药变异和基因分型检测;用DNA测序法对患者的HBV DNA进行测序,确定HBV的耐药变异与基因分型情况,评价PCR-反向点杂交法的准确性、灵敏度及临床应用价值。结果 89例标本经PCR-反向点杂交法检出变异株31例,其中rtL180M+rtM204V联合突变株15例,rtN236T突变株4例,rtM204I突变株9例,rtA181V突变株3例;野生株55例,阴性标本3例;HBV基因型中C基因型72例,B基因型14例。经测序确定PCR-反向点杂交法检测准确度、特异度均为100%。结论采用PCR-反向点杂交法检测HBV基因耐药变异与基因分型可靠、简便、经济、高效,适宜临床推广。

PCR反向点杂交技术快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种的应用研究

目的探讨PCR-反向点杂交技术(PCR-RDBHA)快速鉴定支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid BALF)标本中分枝杆菌菌种的临床应用价值。方法对临床306例活动性肺结核患者、疑似非结核分枝杆菌感染肺病患者BALF标本采用PCR-反向点杂交技术和传统的改良罗氏培养法进行分枝杆菌菌种鉴定。结果 306例BALF标本PCR反向点杂交技术检测出分枝杆菌127例,阳性率为41.5%(127/306),其中结核分枝杆菌复合群(MTC)108例,占分枝杆菌的85.0%(108/127),非结核分枝杆菌(NTM)19例,占分枝杆菌的15.0%(19/127)。NTM中,6例脓肿分枝杆菌,10例胞内分枝杆菌,2例戈登分枝杆菌,1例瘰疬分枝杆菌;传统的改良罗氏培养法检测出分枝杆菌101例,阳性率33.0%(101/306),经菌种的初步鉴定,其中MTC89例,占分枝杆菌的88.1%(89/101),NTM12例,占分枝杆的11.9%(12/101)。结论 PCR反向点杂交技术能够快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种,该方法简便、结果准确,具有良好的临床应用价值。

反向点杂交法快速检测HPV基因型的临床应用

应用反向点杂交法（ＲＤＢ）的原理，针对ＨＰＶ６Ｂ，１１，１６，１８，３１，３３和３５设计了７条序列作为未标记的特异性寡核苷酸（ＳＳＯ）探针，分别固定在尼龙膜条上，形成７个点，再与经ＰＣＲ扩增的样品ＤＮＡ序列杂交，即可在一个膜条上分辨出这７型ＨＰＶ中的任一型．此法快速简便，特异性高，不存在假阳性；且因ＰＣＲ灵敏度高，亦不易出现假阴性．用ＰＣＲＲＤＢ法检测保存的宫颈癌组织石蜡包埋标本３２例，结果：ＨＰＶ１６阳性２２例（６８８％），ＨＰＶ１８阳性５例（１５６％），ＨＰＶ１６／１８双重感染２例（６３％），阴性仅３例（９３％）．

特异性寡核苷酸探针反向杂交在mtDNA点突变检测中的应用研究

目的:建立一种快捷、有效的mtDNA点突变检测体系。方法:线粒体病患者15例,根据临床表现分为3组,线粒体脑肌病伴高乳酸血症、卒中样发作(MELAS)组7例,单纯型线粒体肌病组4例,慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO)组4例。用苯酚/氯仿法提取外周全血DNA,采用PCR/ASO反向杂交技术,用PCR扩增mtDNA的突变“热区”—tRNALeu(UUR)基因,在下游引物的5'端标记上地高辛,与点在尼龙膜上的5对寡核苷酸(ASO)探针:A3243/A3243G(野生型/突变型)、T3271/T3271C、G3460/G3460A、T3291/T3291C、C3256/C3256T进行反向杂交,根据杂交显色信号,确定有无突变。同时利用PCR/RFLP方法加以验证。结果:MELAS组中有A3243G点突变3例,但没有其他4个位点的突变。单纯型线粒体肌病组和CPEO组均未发现以上5个位点的突变。PCR/ASO反向杂交法与PCR/RFLP法结果一致。结论:PCR/ASO反向杂交技术,适用于已知mtDNA点突变的检测,具有敏感、节时、节省费用的特点,尤其适用于大批量标本的筛选。

基于PCR-反向点杂交法对江西地区分枝杆菌感染状况分析

目的了解江西地区分枝杆菌感染流行现状,为临床防治提供科学依据。方法运用PCR-反向点杂交法对345例可疑分枝杆菌感染患者不同标本进行分枝杆菌核酸检测。结果 345份标本中共检出68例阳性(阳性率为19.7%),其中结核分枝杆菌复合群(MTC)59例(占86.76%),非结核分枝杆菌(NTM)8例(占11.77%),混合感染(MTC/MIN)1例(1.47%);NTM感染中检测出5种,分别为偶发/猪分枝杆菌(MFO)、戈登分枝杆菌(MGO)、胞内分枝杆菌(MIN)、龟分枝杆菌脓肿亚肿(MAB)、蟾蜍分枝杆菌(MXE),其中以MIN为主,占5.88%;不同标本中分枝杆菌检出率不同,痰液、灌洗液、分泌物、胸水中分枝杆菌检出率分别为:31.5%、20.3%、16.0%、4.7%。结论江西地区分枝杆菌感染主要以MTC为主,且多为单一感染。

反向点杂交检测肝癌细胞DNA甲基化方法的建立

目的建立反向点杂交(RDB)检测DNA甲基化的方法,并应用于临床肝癌细胞MAGE-A3 5'端CpG位点异常甲基化的检测。方法亚硫酸氢盐修饰后聚合酶链式测序分析细胞株Hep G2和外周血白细胞DNA的甲基化模式差异,建立RDB检测DNA甲基化方法,进行方法学评价,并运用于临床肝癌病理组织标本、肝硬化组织标本和正常对照组。结果 RDB检测肝癌细胞MAGE-A3 5'端CpG位点异常甲基化的灵敏度、特异度和准确性分别是83%(25/30)、100%(60/60)和94%(85/90)。其与临床肝癌诊断金标准的检验结果一致性较好(Kappa=0.870,P<0.05)。结论建立了RDB检测肝癌细胞DNA异常甲基化的方法,并可用于肝癌的临床早期诊断。

PCR反向点杂交技术与DNA测序法检测HPV的对比研究

目的通过PCR反向点杂交技术检测人乳头瘤病毒(HPV),并采用DNA测序法对此方法进行验证,比较两种检测方法的一致性,为临床使用PCR反向点杂交技术进行HPV DNA检测提供准确依据。方法采用PCR反向点杂交技术和DNA测序法对喀什地区第一人民医院妇科门诊收集的27例HPV感染患者进行检测,将两种检测方法得到的检测结果进行比对。结果采用PCR反向点杂交技术和DNA测序法得到的检测结果一致,27例样本中阳性检出率100.0%,其中高危型检出率为85.2%,低危型检出率为14.8%,多重型别感染率为25.9%。结论两种HPV检测方法的结果符合率100.0%,PCR-反向点杂交技术检测结果准确度高,可以为临床诊断提供准确可靠的依据。

反向点杂交法检测中国人N-乙酰化酶基因型

目的 建立快速方便的反向点杂交法 (RDB)检测中国人N 乙酰化酶 (NAT2 )基因型。方法 采用PCR法扩增生物素标记的DNA片段 ,与固定在尼龙膜上的等位基因特异性寡核苷酸探针进行杂交 ,通过非同位素法显色检测杂交结果 ,分析NAT2 5种主要突变位点。用本法对 4 8名肺结核患者NAT2基因型进行了分析。结果 RDB法与等位基因特异扩增法结果完全一致。 4 8名肺结核患者NAT2 5、 6、 73种突变型等位基因的基因频率分别为 1 0 4 %、2 2 9%和 15 6 %。野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子分别为 33 3%、5 4 2 %和 12 5 %。结论 RDB法检测NAT2基因型准确、方便 ,适用于指导临床合理用药。