生物胁迫下黄瓜酵母双杂交cDNA文库构建与鉴定

以黄瓜抗病高代自交系D9320为试验材料,采用Gateway技术构建了黄瓜霜霉病和棒孢叶斑病菌胁迫下黄瓜酵母双杂交cDNA文库。结果表明:酵母文库克隆数为350个,文库滴度为3.5×10^(7)CFU/mL,重组率达到100%,插入片段长度在750~2000bp,平均片段长度超过1000bp。文库容量和重组率及插入片段大小均说明霜霉病菌和棒孢叶斑病菌胁迫下黄瓜酵母双杂交cDNA文库构建成功,可用于黄瓜双抗机制互作蛋白的筛选。

基于酵母双杂交文库鉴定鸡PGCs形成过程中的关键泛素化修饰酶

试验拟筛选与C2EIP互作的蛋白,构建调节PGCs形成过程的泛素化E3连接酶复合体。通过逆转录和同源重组等方法构建鸡PGCs酵母文库;将C2EIP连入诱饵空载体pGBKT7中,并转化酵母感受态细胞进行诱饵载体(C2EIP-pGBKT7)的毒性和自激活检测;将酵母文库与诱饵载体菌液共培养后,通过涂板筛选阳性克隆并进行测序和生物信息学分析筛选互作蛋白。结果显示:成功构建了鸡PGCs酵母文库,其滴度为3.0×10^(6)cfu/mL,总库容为1.5×10^(7)cfu,且重组率为100%,符合筛库要求。成功构建无毒性和不能自激活的C2EIP-pGBKT7诱饵载体,能够用于后续的文库筛选。C2EIP-pGBKT7诱饵载体菌液与酵母文库共培养后,通过PCR测序与蛋白序列分析后共筛选了36个C2EIP的互作蛋白,其中RCJMBM04和CCDC174蛋白功能域分析发现分别具有典型的RING功能域和PPXY基序,进行的生物信息学分析发现WWP1和WWP2具有典型的WW功能域,能够与CCDC174结合。研究表明,试验成功鉴定了C2EIP/RCJMB04/CCDC174/WWP泛素化E3连接酶复合体,为后续研究泛素化修饰调控鸡PGCs形成机制奠定理论基础。

黄瓜单性结实果实酵母双杂交文库的构建及CsCML25互作蛋白的筛选

为研究黄瓜单性结实形成的分子调控机制,以黄瓜单性结实自交系‘EC1’为材料,分别取开花前1 d至开花后4 d的子房,提取RNA后等量混合,采用SMART方法构建酵母双杂cDNA文库。结果表明,构建的文库总克隆数为1.16×107 CFU,平均插入片段长度≥1000 bp,阳性率为100%,符合建库的标准,可用于后续的酵母双杂交筛选。以黄瓜单性结实关键调控因子CsCML25为诱饵,构建pGBKT7-CML25诱饵蛋白表达载体,经自激活活性分析及不同浓度3AT对诱饵蛋白自激活活性抑制效果分析,使用SD-TLH+20 mM 3AT平板可完全抑制诱饵蛋白自激活活性。利用酵母双杂交筛选构建的黄瓜单性结实果实cDNA文库,得到96个初始阳性克隆。利用DNA测序、BLAST分析以及酵母回转验证等方法,最终获得27个可能与CsCML25相互作用的候选蛋白,为从分子水平探究CsCML25调控黄瓜单性结实的机制提供了理论基础。

灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建及分析

以灰飞虱（Laodlphax striatellus Fallen）mRNA为起始模板，利用Gateway技术构建了灰飞虱酵母双杂交cDNA文库。经过检测表明：构建的初级cDNA文库的库容量为1．85×10 7cfu；扩增文库滴度为7．7×10 8cfu／mL，重组率约为97％；扩增文库插入片段主要集中在1000-1500bp之间。随机挑取10个克隆，经测序与GenBank数据库比对结果显示7个克隆具有同源序列，其中L2、L9为已公布的灰飞虱序列。灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建为克隆全长目的基因及研究灰飞虱与其传播的水稻病毒间的互作奠定了基础。

灰飞虱高带毒(RSV)群体酵母双杂交cDNA文库的构建

为了研究灰飞虱Laodelphax striatellus Fallén与水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)互作机制,本研究构建了灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库。以实验室筛选的灰飞虱高带毒群体为材料,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,并连接三框型接头,层析柱分级纯化。采用同源重组反应制备三框型cDNA入门文库,再通过同源重组将入门文库转移到Gateway兼容载体pGADT7-DEST上,构建获得酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明:文库库容量为3.68×107cfu,扩增文库滴度为2.62×1010cfu/mL;文库重组率大于95%,cDNA插入片段平均长度>1kb,达到了标准cDNA文库的要求。灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库的构建为开展昆虫介体与水稻条纹病毒互作机制的研究奠定了基础。

玉米酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmCEN互作蛋白的筛选

为阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。提取玉米(Zea mays L.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA,利用SMART技术反转录合成ds cDNA,构建以pGBKT7为载体的酵母双杂交cDNA文库;依据ZmCEN基因的CDS序列设计引物,构建重组诱饵载体(pGBKT7-ZmCEN)转化酵母菌株Y2HGold,检测诱饵载体的毒性与自激活能力后,筛选与玉米中心蛋白(ZmCEN)互作的猎物蛋白。将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b(TON1b)再次验证相互作用,并选取互作蛋白TON1b,采用BiFC实验分别构建ZmCEN-pSPYNE和TON1b-pSPYCE BiFC半分子重组载体,转化拟南芥原生质体,进一步验证它们在细胞内的互作;并利用Uniprot和KEGG在线网站对互作蛋白进行gene ontology(GO)注释分析。结果表明:玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到2.56×107 CFU,文库滴度5.36×108 CFU/mL,符合建库要求。经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能,所筛选的cDNA文库经测序和Blast比对分析以及共转验证,最终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质。GO注释显示互作蛋白参与的生物过程有21种。BiFC结果显示,蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补,从而产生黄色荧光,进一步证实了两者存在互作关系。酵母双杂交系统cDNA文库的成功构建与筛选,为进一步研究玉米ZmCEN及其与互作蛋白的作用机制奠定了基础。

水稻高盐胁迫下的酵母双杂交文库构建及OsRPK1胞内互作蛋白质的筛选

为了挖掘水稻OsRPK1胞内互作蛋白质,阐明OsRPK1参与高盐胁迫的分子机制,本研究利用SMART技术,构建水稻高盐胁迫下根尖的酵母双杂交文库。PCR扩增获得OsRPK1基因编码胞内区域的碱基序列,构建诱饵表达载体(pGBKT7-OsRPK1-CD),检测诱饵表达载体在酵母中的毒性和自激活活性,筛选OsRPK1胞内互作蛋白,进一步分析高盐胁迫下候选基因的表达模式。结果表明,构建的cDNA文库库容量为1.11×10~7 CFU,文库重组率为96%,文库插入片段多态性较好。成功构建了诱饵表达载体(pGBKT7-OsRPK1-CD),经检测诱饵表达载体无毒性,无自激活活性。诱饵表达载体与cDNA文库进行双杂交筛选,经测序和比对分析获得了11个重要的候选基因,检测候选基因在高盐处理下的表达情况,其中8个候选基因受高盐诱导表达,2个候选基因受高盐胁迫抑制表达,1个候选基因受高盐胁迫瞬时诱导表达后表达量又受到显著抑制。

酵母双杂交技术对人胰腺cDNA文库中HBcAg结合蛋白基因的筛选

目的:应用酵母双杂交技术,筛选人胰腺cDNA文库中与HBV核心抗原结合的蛋白的基因.方法:扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定,将其转化至酵母菌Y187;诱饵质粒pGBKT7-HBcAg转化酵母菌AH109并筛选鉴定.应用酵母双杂交系统3进行配合,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基和含X-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上进行双重筛选,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌DH5α,提取质粒并测序,对测序结果进行生物信息学分析.结果:人胰腺cDNA文库的构建以及pGBKT7-HBcAg质粒转化AH109酵母菌株均获成功,并从人胰腺cDNA文库中筛选出9个与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因,分别与以下已知的9种编码蛋白基因序列同源:人胰脂肪酶(PNLIP)、人胆盐刺激酯酶(CEL)、人胰凝乳蛋白C(CTRC)、人胰蛋白酶原、人羧肽酶B1(CPB1)、人线粒体全基因组、人胰弹性酶2A、人辅脂肪酶(CLPS)和人核糖体蛋白(RPL10A).结论:筛选出的与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因主要与胰腺外分泌功能相关,HBV感染可能通过与胰腺所分泌的糖、脂类代谢相关的酶类结合,而引发代谢性疾病.

黄萎病菌诱导海岛棉酵母双杂交cDNA文库构建及评价

采用SMARTTM c DNA合成技术,通过同源重组方法构建了海岛棉Pima90-53经强致病力黄萎病菌诱导的酵母双杂交c DNA文库。经测定,文库容量为2.82×106,滴度为5.02×108 cfu/m L。菌落PCR显示,重组到p GADT7-Rec载体上的c DNA片段大小集中在500-1 500 bp之间,重组率93.33%。该文库完全可用于下一步互作蛋白筛选、信号转导组件确定及抗病蛋白结构和功能分析。

鸡胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

选取对新城疫病毒（NDV）易感的鸡胚成纤维细胞（CEF）,Trizol提取细胞总RNA,用SMART技术合成双链cDNA,然后利用同源重组的方法在酵母细胞内构建CEF的cDNA文库,以寻找与NDV基质（M）蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,探讨其相互作用对NDV装配和出芽的影响。结果表明：提取的细胞总RNA的D260 nm/D280 nm为1.96,甲醛变性琼脂糖凝胶显示RNA未发生降解,质量良好。获得的文库容量为3×106cfu,插入的双链cDNA片段大小为0.3~3 kb,平均长度为1.3 kb左右,文库重组率为100%。该文库的构建为发现和研究与NDV M蛋白相互作用的宿主细胞蛋白提供有效工具。

结肠癌羟基喜树碱耐药细胞SW1116/HCPT酵母双杂交cDNA文库的构建和鉴定

目的:构建羟基喜树碱耐药结肠癌细胞株SW1116/HCPT细胞的酵母双杂交cDNA文库.方法:用TRIzol从SW1116/HCPT细胞提取总RNA,采用CLONTECH SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)技术和同源重组(homologous recombination)的方法构建SW1116/HCPT细胞的cDNA文库.结果:提取的RNA的A260/A280为1.98,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳示出28SrRNA、18SrRNA及5SrRNA3条特异性带,28S与18S带浓度及亮度比值约为2.文库dscDNAsmear较长分布在0.1-5kb,成长瀑布条带,而且在接近1kb的区域有密集的带子,为高丰度表达基因.依据生长菌落计数,共获得(1.2-1.9)×106个转化子,重组率达93.7%,文库插入片段大小为0.2-5kb.结论:成功构建了SW1116/HCPT cDNA文库.

PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建及鉴定

【目的】构建PK-15细胞酵母双杂交三框eDNA文库，为深入研究猪伪狂犬病病毒（PRV）与宿主细胞间的相互作用机制打下基础。【方法】提取PK-15细胞总RNA，采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA（dscDNA），并对其进行均一化和SfiI酶切处理。，处理后的dscDNA分别连接3种阅读框pGADT7-SfiI载体，将连接产物转化至大肠杆菌BH5α构建三框cDNA初级文库，取三框cDNA初级文库进行混合扩增，通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率，最后收集文库细菌提取文库质粒。【结果】3种读码框cDNA文库的库容量分别为3．0×10^6,2．0×10^6和2．0×10^6CFU，文库实际扩增基数〉150万CFU；一号和三号读码框的基因重组率均为100％，二号读码框的基因重组率大于93％。cDNA文库外源基因插入片段长度在500～3000bp。cDNA文库质粒浓度约1．0mg/mL，质粒收获量约3．0mg。【结论】构建的PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库具有较高的重组率和库容量，符合酵母双杂交筛选要求，可用于研究PRV与PK-15细胞间的相互作用机制。

两个水稻品种(系)酵母双杂交cDNA文库的构建和比较分析

"武育粳3号"和"KT95-418"为两个遗传背景基本一致而对水稻条纹叶枯病表现为明显抗性差异的粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)品种(系)。利用SMART技术合成双链cDNA后,通过SfiⅠ酶切位点将cDNA片段定向插入到改造的载体NpGADT7中,构建了两品种(系)水稻的酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明:所构建的两个文库库容量均大于1.0×106cfu;初始文库滴度分别为1.0×1010cfu/mL和5.0×1010cfu/mL,扩增文库滴度均为1.0×1011cfu/mL;两文库重组率均大于95%;"武育粳3号"文库cDNA插入片段长度集中分布在700bp^800bp之间,"KT95-418"集中分布在750bp^1000bp之间;小规模测序结果表明两文库中全长基因的比例均超过60%。两品种(系)水稻酵母双杂交cDNA文库的构建为筛选分离抗病相关的变异基因及开展寄主与水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)互作的研究奠定了基础。

玉米根部酵母双杂交cDNA文库的构建及评价

从玉米各生长时期的根部中提取总RNA后,再利用磁珠法从中分离纯化出mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(dscDNA)。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母菌株AH109中构建了玉米根部全长cDNA文库。经检测,文库的转化率为1.76×107转化子/3μgpGADT7-Rec,文库滴度为1.17×106pfu/mL,重组率为95%。

大鼠肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与筛选

目的构建脂多糖（LPS）和地塞米松（Dex）作用后的肺泡巨噬细胞（AMs）酵母双杂交cDNA文库，探寻炎症条件下与糖皮质激素受体（（讯）相互作用的蛋白质分子。方法用LPS（10mg／ml）和Dex（10^-5mol／L）作用于原代培养的肺泡巨噬细胞4h后，从肺泡巨噬细胞中提取总RNA，再以SMARTⅢ^TM和CDSⅢoligo（dT）为引物进行PCR扩增，得到两端具有同源臂的双链cDNA，后者纯化后，与线性质粒pGADTZ-Rec共转化感受态酵母菌AH109，二者在酵母细胞中同源重组成环形的有复制活性的cDNA文库质粒，收集在缺亮氨酸（Leu）培养板上筛选出所有克隆，即为AMs酵母双杂交文库菌。进而通过诱饵质粒pGBKT7-GR转化构建成功的文库菌，筛选与GR相互作用的蛋白分子。结果构建了具有基因多样性和库容量足够大的AMscDNA文库，共获得1．07×10^6个转化子，插入的双链cDNA片段的长度在0．3～1．5kb之间。筛选文库获得1个真阳性克隆，经测序和同源性比较证实该克隆为BAG-1。结论利用Clontech SMART技术成功构建了肺泡巨噬细胞的酵母双杂交cDNA文库；GR与BAG-1在酵母细胞中存在着相互作用。

小粒野生稻酵母双杂交cDNA文库的构建

采用酵母双杂交系统,利用SMART技术,在酵母菌株AH109中构建了小粒野生稻全长cDNA文库,文库容量约为1×106,插入片段平均大小约为640bp。该文库可以用于进一步的酵母双杂交筛选。

玉米叶片酵母双杂交cDNA文库的构建及评价

以玉米骨干自交系478为试验材料,从各生长时期的叶片中提取总RNA后,再利用磁珠法从中分离纯化出mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA)。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母菌株AH109中构建了玉米叶片全长cDNA文库。经检测,文库的转化率为1.54×107转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.03×106pfu/mL,重组率为95%。

辣椒疫霉菌诱导辣椒酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是在世界范围内广泛分布的毁灭性病害之一,对我国辣椒生产造成严重的经济损失。为深入研究辣椒疫霉的致病机制,寻找辣椒疫霉在辣椒体内的互作蛋白,利用SMART同源重组交换技术,在酵母菌株Y187中构建了被辣椒疫霉侵染不同时期辣椒的cDNA文库。文库质量评定结果显示cDNA文库的滴度为1.13×10~6 CFU/m L,文库的库容量为1.7×10~7 CFU,文库的重组率为96%,插入片段平均长度在1Kbp左右。该文库的构建为研究辣椒疫霉的致病机制、辣椒的抗病机制及寻找药物靶标位点奠定基础。

利用同源重组构建人脑的酵母双杂交cDNA文库

目的 利用SMART（switching mechanism at 5′end of RNA transcript）技术，通过同源重组的方法，在酵母菌株Y187中构建人脑全长cDNA文库。方法 利用SMART技术，以人脑总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。再在DNA聚合酶下，通过长距离PCR，扩增双链cDNA。同时构建pGADT7-Rec质粒载体。纯化的ds cDNA与线性化pGADT7-Rec质粒载体共同转化酵母菌株感受态Y187，经胞内同源重组形成环状文库质粒。应用营养缺陷的方法在SD／-Leu平板上筛选并收集所有克隆从而获得酵母双杂交的人脑cDNA文库。结果 所获得的文库容量为1．2×10^6，重组子不同插入片断大小在0．3～2kb之间。结论 在酵母菌株Y187成功构建了用于酵母双杂交的人脑cDNA文库。

大豆高盐胁迫下根部组织酵母双杂交文库的构建与分析

为了高效研究大豆耐非生物胁迫的分子调控网络,运用SMART(Switching Mechanism at 5'End of the RNA Transcript)与DSN(Duplex-Specific Nulease)相结合的技术构建了栽培大豆高盐胁迫下根部组织的酵母双杂交cDNA文库。提取高质量的总RNA,利用Oligo(dT)_(16)引物反转录合成cDNA后,经DSN处理,然后利用Advantage 2聚合酶进行长片段PCR扩增,电泳检测显示,产物均一,无高丰度条带,片段范围在0.75~5.00 kb;RT-PCR结果显示,GmActin基因在均一化后表达明显降低,表明均一化效果较好;最后通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株Y18 7中构建了酵母双杂交所需的cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的总独立克隆数为5.61×10~6 cfu、文库滴度为3.4×10^(10)cfu/mL、重组率大于90%、插人片段长度为0.5~3.0 kb,主要集中在1.0 kb左右。