增塑剂DEHP通过铁死亡途径抑制小鼠GC-1 spg精原细胞生长

目的:探究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)损伤小鼠GC-1 spg精原细胞功能的可能机制。方法:采用不同浓度DEHP(0、30、60、90、120μmol/L)处理GC-1 spg细胞,通过CCK8实验、克隆形成实验和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力的变化;化学分光光度比色法检测细胞内铁离子(Fe 3+)和丙二醛的相对含量;蛋白质印迹实验检测细胞内铁死亡相关蛋白胱氨酸/谷氨酸逆转运蛋白(xCT)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的相对表达;细胞免疫荧光染色技术检测细胞内活性氧水平以及线粒体膜电位(JC-1)的改变。使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(1μmol/L)与DEHP(90μmol/L)联合培养GC-1 spg细胞24 h,CCK8实验检测细胞的增殖能力。结果:与对照组(0μmol/L)相比,30、60、90、120μmol/L DEHP组细胞的增殖能力、克隆形成能力和迁移能力明显下降;丙二醛、活性氧、Fe 3+(90、120μmol/L DEHP组)含量明显升高;线粒体膜电位(60、90、120μmol/L DEHP组)明显降低;GPX4(60、90、120μmol/L DEHP组)和xCT蛋白表达水平明显降低。DEHP与Ferrostatin-1联合培养后细胞增殖能力较DEHP单独培养明显提高。结论:DEHP能够抑制GC-1 spg细胞的增殖和迁移能力,降低GPX4和xCT蛋白的表达,可能通过铁死亡途径引起细胞死亡。

白藜芦醇对Gc-1spg细胞氧化应激损伤的作用研究

目的观察白藜芦醇(RES)对过氧化氢H_(2)O_(2)诱导的小鼠精原细胞(Gc-1 spg)氧化应激损伤的作用。方法H_(2)O_(2)复制Gc-1 spg细胞氧化应激损伤模型,设置空白组、H_(2)O_(2)组(800µmol/L)、H_(2)O_(2)+5µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+10µmol/L RES组和H_(2)O_(2)+15µmol/L RES组。检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平,CCK-8法检测细胞活力,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,Mito Tracker®®Green FM试剂盒检测活细胞线粒体水平,Hoechst 33342染色检测细胞核凋亡率,Western blotting检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3表达。结果浓度为800µmol/L H_(2)O_(2)处理Gc-1 spg细胞6 h时达到实验要求(P<0.05)。与空白组比较,各H_(2)O_(2)组细胞活力降低(P<0.05),与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+5µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+10µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+15µmol/L RES组细胞活力升高(P<0.05)。与空白组比较,各H_(2)O_(2)组的GSH-Px和SOD水平降低(P<0.05),LDH和MDA水平升高(P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+5µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+10µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+15µmol/L RES组GSH-PX和SOD水平降低(P<0.05),LDH和MDA水平升高(P<0.05)。与空白组比较,H_(2)O_(2)组细胞的红/绿荧光比值降低,提示线粒体膜电位降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+5µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+10µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+15µmol/L RES组JC-1红/绿荧光比值升高(P<0.05)。与空白组比较,H_(2)O_(2)组细胞线粒体数明显减少(P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+5µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+10µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+15µmol/L RES组细胞荧光强度升高(P<0.05)。与空白组比较,H_(2)O_(2)组大量细胞核皱缩、碎裂,染色程度明显增强,细胞凋亡严重;与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+5µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+10µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+15µmol/L RES组细胞凋亡率降低(P<0.05)。与空白组比较,H_(2)O_(2)组凋亡蛋白Bax和Caspase-3相对表达量增加(P<0.05),Bcl-2相对表达量减少(P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+5µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+10µmol/L RES组、H_(2)O_(2)+15µmol/L RES组Bax和Caspase-3相对表达量降低(P<0.05),Bcl-2相对表达量增加(P<0.05)。结论RES对H_(2)O_(2)诱导的Gc-1 spg细胞氧化应激损伤具有保护作用,这种保护作用与RES浓度有关。

枸杞多糖对小鼠GC-1spg精原细胞氧化损伤的保护作用研究

目的研究枸杞多糖(LBP)对小鼠GC-1spg精原细胞氧化损伤的保护作用,探讨其治疗男性不育症的作用及机制。方法通过次黄嘌呤-黄嘌呤(HX-XO)氧化酶体系建立体外小鼠GC-1spg精原细胞氧化应激模型,分别以50、100、200μg·mL^(-1)的LBP为低、中、高剂量设定给药组,另设空白组和模型组,培养24 h,MTT比色法测定细胞活力,通过测定细胞内丙二醛(MDA)的生成量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性、谷胱甘肽(GSH)水平评价LBP对小鼠GC-1spg精原细胞氧化损伤的保护作用,通过检测细胞中Caspase-3和Caspase-9的活性,评价LBP对小鼠GC-1spg精原细胞凋亡的影响。结果不同浓度的LBP可以显著改善HX-XO诱导的小鼠GC-1spg精原细胞氧化损伤,提高细胞活性,降低MDA生成量,提高SDO、CAT活性和GSH水平,降低Caspase-3和Caspase-9的活性,抑制细胞凋亡。结论LBP可通过抗氧化作用对小鼠GC-1spg精原细胞氧化损伤起保护作用,改善细胞凋亡,提高细胞活力,可作为改善男性不育症的潜力药物。

mTSARG3真核表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建小鼠mTSARG3基因真核表达载体,转染小鼠精原细胞系GC-1,建立稳定转染mTSARG3的GC-1细胞系,利用流式细胞技术(FCM)进行初步功能研究。方法:应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框(ORF),并将PCR产物插入到pGEM-TEasy载体中测序验证。随后,经NotI和Hind III酶切后将目的片段进一步克隆到pcDNA3.1 Hygro(-)真核表达载体中。将经过测序验证的pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒转染GC-1细胞,通过潮霉素筛选建立mTSARG3稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测mTSARG3在稳定转染的GC-1细胞系中的表达;FCM观察转染pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3重组质粒)对GC-1细胞周期和凋亡的影响。结果:成功构建了pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒,建立了稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测结果发现,mT-SARG3在GC-1细胞系中成功表达。进一步通过FCM检测分析发现,转染mTSARG3可促进GC-1细胞增殖,抑制细胞凋亡。结论:mTSARG3真核表达载体的成功构建和稳定转染重组质粒GC-1细胞系的建立为进一步体外研究mTSARG3的功能奠定了基础。

白藜芦醇介导AMPK/mTOR信号通路调控线粒体自噬缓解小鼠精原细胞氧化应激损伤和凋亡

目的观察白藜芦醇(resveratrol,RES)是否通过腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(amp-activatedproteinkinase/mammalian target of rapamycin,AMPK/mTOR)信号通路调控线粒体自噬缓解小鼠精原细胞(Gc-1 spg)氧化应激损伤。方法设置空白对照组(Control)、过氧化氢组(H_(2)O_(2))、H_(2)O_(2)+RES组、H_(2)O_(2)+RES+AMPK抑制剂(Compound C,CC)组,各组给予相应处理后。CCK-8检测细胞活力,试剂盒检测过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物(glutathione peroxidase,GSH-PX)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)SOD、MDA、GSH-PX、LDH和ATP水平,JC-1检测线粒体膜电位,MitoTracker?Green FM检测活细胞线粒体形态,Hoechst 33342染色检测细胞核凋亡率,透射电镜观察细胞超微结构及线粒体自噬变化,Western blot检测凋亡蛋白Bcl-2关联X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、B细胞淋巴瘤-2蛋白(B-cell lymphoma 2 protein,Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-3),自噬蛋白微管相关蛋白轻链3(light chain 3,LC3)、P62,通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR表达水平。结果H_(2)O_(2)促进Gc-1 spg细胞氧化应激损伤,激活AMPK/mTOR信号通路和线粒体自噬,提高p-AMPK/AMPK和LC3表达并降低p-mTOR/mTOR和P62表达;RES能缓解Gc-1 spg细胞氧化应激损伤,进一步提高p-AMPK/AMPK和LC3表达,降低p-mTOR/mTOR和P62表达,促进Gc-1 spg细胞线粒体自噬;AMPK抑制剂能逆转RES对Gc-1 spg细胞氧化应激损伤的保护作用,抑制SOD和GSH-PX活性并增加MDA和LDH水平,降低细胞线粒体膜电位,增加线粒体损伤,破坏细胞核,增加Bax、Caspase-3和P62表达水平并降低Bcl-2和LC3表达水平,增加细胞凋亡率,降低线粒体自噬。结论RES可能通过AMPK/mTOR信号通路促进Gc-1 spg细胞线粒体自噬缓解线粒体氧化应激损伤和细胞凋亡。

Cu2+对小鼠精原细胞活性氧及线粒体功能的影响

通过终浓度含Cu^2+为0μmol/L(对照组)、10μmol/L(低浓度组)、50μmol/L(中浓度组)、100mol/L(高浓度组)的体外培养体系分别处理小鼠精原细胞(GC-1 spg细胞),在培养12、24、36 h时,应用流式细胞仪检测GC-1 spg细胞的活性氧(ROS)水平及线粒体膜电位(Δψm)变化,应用高分辨率呼吸仪检测基础呼吸、质子漏、呼吸控制比率(RCR)、剩余氧通量(ROX),以评价不同浓度Cu^2+对体外培养GC-1 spg细胞ROS产生及线粒体功能的影响。结果显示:与对照组相比,培养12 h三个Cu^2+处理组的ROS水平显著升高,低浓度组和中浓度组的ROX显著升高,Δψm、基础呼吸、质子漏和RCR无明显变化;培养24 h中浓度组和高浓度组的ROS和ROX显著升高,三个Cu^2+处理组Δψm、中浓度组和高浓度组的基础呼吸和高浓度组的RCR显著下降,质子漏无明显变化;培养36 h中浓度组和高浓度组ROS水平显著升高、三个Cu^2+处理组的质子漏、ROX显著升高,三个Cu^2+处理组的Δψm、中浓度组和高浓度组的RCR显著下降,基础呼吸无明显变化。结果表明:在Cu^2+处理的GC-1 spg细胞中,ROS的产生先于Cu^2+诱导的线粒体功能障碍。