sRNA GcvB对鼠伤寒沙门菌毒力的调控作用研究

小RNA(sRNA)是一种调节分子,可以在转录后水平调节基因表达,从而改变细菌的生理特征。为了研究sRNA GcvB在鼠伤寒沙门菌毒力中的调控作用,本研究构建了GcvB基因缺失株、互补株及示踪菌,检测其对鼠伤寒沙门菌生物被膜形成及泳动能力的影响;分析亲本株与缺失株在毒力及感染动力学上的差异,预测并分析了GcvB调控的潜在靶基因,探究了GcvB对ST生物被膜、氧化应激和毒力的调控作用。结果显示,与亲本株和回补株相比,GcvB缺失后生物被膜形成能力升高、抗氧化应激能力显著增强;半数致死量(LD50)上升至3.98倍。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测靶基因gcvA、bapA、hilA、igaA及sitD,结果显示gcvA、bapA、igaA及sitD的转录水平表达量上调,而hilA下降。本研究证实sRNA GcvB参与了鼠伤寒沙门菌生物被膜形成、氧化应激和毒力作用,为揭示sRNA GcvB在ST生物被膜、氧化应激和毒力中的调控机制提供了研究基础。

敲除小RNA gcvB后沙门菌的转录组分析

为筛选与沙门菌小RNA gcvB相关的靶基因,采用高通量的转录组测序(RNA-seq)技术对野生型沙门菌和敲除小RNA gcvB沙门菌的mRNA进行对比分析,全面地预测GcvB的靶基因的数量与种类,通过GO和KEGG数据库对筛选基因进行比对注释,进一步分析筛选基因的主要功能及涉及的生物过程。并利用荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证。结果显示:差异表达基因共1 244个,其中基因表达上调678个,基因表达下调566个。GO富集分析显示,差异表达基因主要涉及氧化还原活性、铁离子结合、运动活性等分子功能,细菌鞭毛的细胞成分,细胞呼吸、钴胺素代谢过程和钴胺素生物合成过程等生物过程。KEGG数据库分析显示,差异表达基因主要参与细菌趋化性、卟啉和叶绿素代谢、不同环境中的微生物代谢、双组分系统、甲烷代谢等14个信号通路。对筛选出的10个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,结果显示:差异表达基因相对表达量与RNA-seq测序结果基本一致。本研究为进一步探明小RNA gcvB与靶基因相互作用、小RNA的调控机制,以及沙门菌致病机制奠定了基础。

沙门菌sRNA GcvB及伴侣蛋白Hfq对靶基因stm4351的调控作用

为探究sRNA GcvB与伴侣蛋白Hfq对靶基因stm4351的调控作用,通过λred同源重组、FLP/FRT重组和转导构建了基因缺失菌株Δstm4351∷lacZ、stm4351ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat,并通过β-半乳糖苷酶(LacZ)试验和荧光定量PCR试验测定了gcvB与hfq缺失后LacZ活性和stm4351转录水平的变化情况.β-半乳糖苷酶试验结果显示:gcvB或hfq缺失菌株的LacZ活性均升高,表明stm4351基因的蛋白表达水平升高;hfq缺失菌株的LacZ活性高于gcvB缺失菌株;hfq和gcvB同时缺失后,LacZ活性比单缺失菌株高.荧光定量PCR结果显示:hfq缺失后,stm4351的转录量极显著下降;而gcvB缺失及hfq和gcvB同时缺失对stm4351转录量的影响不显著.以上结果说明:GcvB、Hfq均对stm4351的表达存在抑制作用;在Hfq的辅助作用下,GcvB对stm4351表达的抑制作用增强;Hfq协同GcvB对stm4351的调控途径可能有2种或更多;同时,Hfq对stm4351的保护或激活作用可能受到GcvB的影响.

鼠伤寒沙门菌小RNA GcvB靶基因的预测与验证

为筛选鼠伤寒沙门菌小RNA GcvB调控的靶基因,本研究通过TargetRNA2软件预测能与GcvB R1、R2和R3区产生作用的基因,将鼠伤寒沙门菌gcvB基因敲除株的转录组测序结果注释到KEGG数据库以及GO富集分析,并利用荧光定量PCR对预测的靶基因进行验证。TargetRNA2的预测结果显示,杂交能量最高的narY、yeaK、trpB和STM2732基因均能够和小RNA GcvB产生至少7个连续的碱基互补,narY、yeaK和trpB基因分别与鼠伤寒沙门菌无氧呼吸、脯氨酸与tRNA的识别以及色氨酸的合成相关。荧光定量PCR检测结果显示,narY、yeaK、trpB和STM2732基因在gcvB基因敲除条件下转录水平分别上调3.4、9.8、12.1和18.37倍。以上结果表明,narY、yeaK、trpB和STM2732基因受小RNA GcvB的负调控且可能为直接负调控。本研究为进一步探明小RNA GcvB与靶基因相互作用、小RNA的调控机制以及沙门菌致病机制奠定了基础。