滩寒杂交F1代BMP15和GDF9基因多态性及不同基因型对繁殖性状影响的研究

为了研究绵羊高繁殖力候选基因骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15, BMP15)基因和生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因的多态性及不同基因型对滩寒杂交F1代群体繁殖性状的影响,试验以采集的915份滩寒杂交F1代群体血液样本为研究对象,采用飞行时间质谱基因分型技术进行SNP位点分型和遗传多态性分析,并利用Sanger测序技术进行验证,然后对不同基因型与滩寒杂交F1代群体繁殖性状和泌乳性状分别进行关联分析。结果表明:BMP15和GDF9基因SNP位点在915份DNA样本中均呈集中聚类分布。滩寒杂交F1代群体BMP15和GDF9基因均存在AA、AB、BB 3种基因型,其中BMP15基因在滩寒杂交F1代群体中的优势等位基因为A基因,基因型频率为0.69;GDF9基因在滩寒杂交F1代群体中的优势等位基因为A基因,基因型频率为0.58。BMP15和GDF9基因SNP位点在滩寒杂交F1代群体中均处于中度多态,GDF9基因处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。BMP15和GDF9基因AA基因型在滩寒杂交F1代群体中的产羔数均高于AB和BB基因型,其中BMP15基因AA和BB基因型第2胎次产羔数显著高于AB基因型(P<0.05),AA基因型第3胎次产羔数显著高于AB和BB基因型(P<0.05);GDF9基因型AA和AB基因型第1胎次产羔数显著高于BB基因型(P<0.05)。滩寒杂交F1代BMP15基因AA基因型有421只,GDF9基因AA基因型有315只泌乳周期为>90 d~<150 d,经计算占比均高于50%,并且与AB、BB基因型比较均差异显著(P<0.05)。说明BMP15和GDF9基因的多态位点与AA基因型有可能成为提高滩寒杂交群体繁殖性状的分子标记。

过表达和干扰GDF9基因对番鸭颗粒细胞凋亡和周期的影响

实验旨在探究生长分化因子9(Growth Differentiation Factor,GDF9)基因对番鸭颗粒细胞的影响,本研究构建了GDF9过表达载体(pEX-2-GDF9)以及干扰GDF9小RNA (siRNA-GDF9-530、siRNAGDF9-978、siRNA-GDF9-1320),分别转染至原代番鸭颗粒细胞内,通过流式细胞术检测GDF9基因对细胞周期和凋亡的影响;荧光定量PCR技术检测转染后颗粒细胞周期和凋亡相关基因的表达量。结果显示,过表达GDF9基因将番鸭颗粒细胞阻滞在G0/G1期,S期细胞极显著减少,且Bax基因和Caspase-3基因表达量极显著(或显著)上调,说明过表达GDF9促进了颗粒细胞凋亡;干扰GDF9基因表达后,G0/G1期细胞极显著减少,S期细胞极显著增加,且CDK-2、Bcl-2、CCND1 mRNA极显著上调,CCNE1 mRNA显著上调。综上可知,GDF9基因表达促进颗粒细胞凋亡、抑制细胞周期进程。该结果可为番鸭的卵泡发育机制研究提供理论基础。

绵羊GDF9基因mRNA、DNA和调控区序列克隆及其在11个品种中遗传多态性检测

本研究旨在克隆绵羊生长分化因子9（Growth differentiation factor 9,GDF9）基因mRNA、DNA和调控区全序列,并检测其在11个绵羊品种中的遗传多态性,探究GDF9基因与绵羊多羔性状的关系。首先应用RACE和PCR技术克隆GDF9基因全长序列,其次利用SNaPshot分型技术检测11个绵羊品种GDF9基因遗传多态性。结果显示,克隆获得GDF9基因mRNA全长1 852bp（GenBank序列号：KR063137）,编码区两侧翼分别具有5′-UTR58bp（1~58nt）和3′-UTR 432bp（1 421~1 852nt）。进一步克隆获得长为2 898bp的DNA序列和2 304bp的调控区序列,分析发现调控区序列比数据库序列（NC_019462.1）多两个长片段。序列比对发现了已知突变G260A（G1）和调控区新突变-2078C〉G。分型结果显示,11个绵羊品种均不含FecGE、FecGH、FecGT、FecGF、FecGV突变,而G260A和-2078C〉G广泛存在于除草原型藏羊外的各绵羊品种中,G260A表现3种基因型（AA、BB和AB）,首次在小尾寒羊和山谷型藏羊中检测到BB型突变纯合子。-2078C〉G也存在3种基因型,基因型结果表明该位点与G260A完全连锁。关联分析结果显示,小尾寒羊AB型产羔数显著高于AA型（P〈0.05）。本研究完善了绵羊GDF9mRNA、DNA和调控区全长序列,为进一步研究GDF9基因功能奠定了基础。同时在不同绵羊品种中发现了G260A和-2078C〉G突变,其中G260A作为潜在的有效遗传标记可用于提高绵羊的产羔数。

16种山羊和6种绵羊GDF9基因G7和FecG^V突变检测

生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)是第一个被发现的由卵母细胞分泌的生长因子,能直接影响动物的产仔数。G7或c.1111G>A突变是Belclare和Cambridge绵羊GDF9基因编码区1111 bp处发生的G→A突变,导致第371位氨基酸由Val改变为Met(V371M)。G7突变对挪威白绵羊的产羔数有显著影响。Fec GV是高产的Ile de France绵羊GDF9基因编码区943 bp处发生的C→T突变(c.943C>T),导致非保守氨基酸Arg改变为Cys(p.Arg315Cys)。Fec GV突变杂合子绵羊的排卵数和产羔数显著高于野生型。采用测序方法检测Fec GV突变和PCR-RFLP方法检测G7突变在16个山羊品种(济宁青山羊、贵州白山羊、成都麻羊、萨能奶山羊、板角山羊、关中奶山羊、辽宁绒山羊、大足黑山羊、古蔺马羊、波尔山羊、内蒙古绒山羊、金堂黑山羊、川东白山羊、安哥拉山羊、圭山山羊和太行山羊)和6个绵羊品种(小尾寒羊、洼地、湖羊、杜泊、黑萨福克和中国美利奴)中的分布情况。结果表明,在16个山羊品种和6个绵羊品种中均未检测到G7和Fec Gv突变,提示GDF9基因G7和Fec Gv突变对以上山羊和绵羊品种的繁殖力均没有显著影响。

BMPR-IB、BMP15和GDF9基因作为滩羊繁殖性状主效候选基因的研究

以控制绵羊高繁殖力的BMPR-IB、BMP15和GDF9基因为候选基因,采用PCR-RFLP方法分析滩羊BMPR-IB,BMP15和GDF9基因多态性与繁殖性状的关系。试验结果表明,滩羊的BMPR-IB基因出现了两个SNP位点,且在相应位置发生了与Booroola羊相同的突变(A746G),该基因++基因型在滩羊群体内是优势基因型,但是双胎母羊和其后代的BB和B+基因型频率均高于单胎母羊,双胎羔羊和单胎母羊++和B+基因型频率最小二乘均值差异显著(P<0.05),两个母羊群体各基因型之间平均产羔数差异不显著(P>0.05),从而推测含有BMPR-IB基因突变的滩羊具有产双羔的潜力,可以作为滩羊选种选育的一项指标。而BMP15基因的B4突变(G→T)和GDF9基因的G8突变(C→T)在滩羊上不表现多态性,因此排除了BMP15基因的B4突变和GDF9基因的G8突变是影响滩羊繁殖性能的可能性。

绵羊BMP15和GDF9基因多态性与产羔性能间的关系

本研究采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术分别对骨形态发生蛋白15(BMP15)基因FecXG突变和FecXL突变、生长分化因子9(GDF9)基因外显子Ⅰ、外显子Ⅱ部分核苷酸多态性及其与小尾寒羊、中国美利奴(新疆型)绵羊多胎品系、肉用品系、体大品系、萨福克、无角陶赛特、中国美利奴(新疆型)和德国肉用美利奴产羔数间的关系进行了分析,结果发现:(1)利用PCR-RFLP技术分析了小尾寒羊等8个品种BMP15 FecXG突变,在该位点未发现多态性;(2)利用PCR-SSCP技术分析了小尾寒羊等8个品种BMP15 FecXL所在区域的多态性,在BMP15基因存在G1047A转换,但并不引起BMP15氨基酸序列的改变,该突变与FecXL(G962A)不同,是在BMP15中新发现的一个突变。G1047A突变对小尾寒羊等7个品种的平均产羔数无显著影响;(3)在小尾寒羊等8个群体的GDF9外显子Ⅰ均未发现多态性;(4)在小尾寒羊等8个群体中发现存在G4突变,该突变对绵羊平均产羔数均无显著影响。以上结果提示:上述2个基因的4个分析区域不宜用于小尾寒羊等7个品种绵羊多羔性状的分子标记位点。

贵州白山羊GDF9基因外显子2的多态性研究

生长分化因子9(GDF9)是卵母细胞分泌的生长因子,对早期卵泡的生长和分化起重要的调节作用。采用RFLP和SSCP方法检测贵州白山羊GDF9基因外显子2的单核苷酸多态性,结果表明:在所有检测样本中均未发现GDF9基因的FecGH突变;在高繁殖率(3羔以上/胎)母羊和公羊中检测到8个杂合的AB基因型,其中5个为高产的母羊,3个为公羊。碱基序列分析证实GDF9基因编码区第1189bp位点的碱基由G突变为A,该位点位于外显子2中,导致活性肽第79位缬氨酸突变为异亮氨酸(V79I),但在低繁殖率(1~2羔/胎)母羊中没有发现该突变。虽然贵州白山羊GDF9基因中G1189A突变的发生率仅为5%,但该位点编码的氨基酸与FecGH突变(S77F)仅相隔1个氨基酸,因此推测GDF9基因中的G1189A突变可能与贵州白山羊的高繁殖力有关。

绵羊GDF9基因FecTT突变检测

FecTT是冰岛Thoka绵羊GDF9基因外显子2编码区1279位发生的A→C突变(A1279C),导致编码GDF9蛋白C末端成熟肽第109位丝氨酸改变为精氨酸(S109R),该突变纯合子母羊不育,杂合子母羊产羔数比野生型多0.6只。本研究采用PCR-RFLP方法分析了GDF9基因FecTT突变在小尾寒羊、洼地绵羊、湖羊、考力代、白萨福克、黑萨福克、东弗里生、杜泊绵羊、特克塞尔、多赛特和中国美利奴11个绵羊品种中的分布。结果表明在11个绵羊品种中都没有检测到GDF9基因的FecTT突变,提示GDF9基因影响Thoka绵羊高繁殖力的FecTT突变对以上11个绵羊品种的繁殖力均没有显著影响。

猪FSHβ和GDF9基因中Alu插入序列多态性

使用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术,对辽宁黑猪、长白猪、大约克猪、丹育猪和杜洛克猪的FSHβ亚基基因和GDF9基因的插入片段扩增后进行多态性和生物信息学分析,并对产仔数建立GLM模型,探讨2个基因插入序列Alu的多态性与猪产仔数的关系。研究表明:优势基因型BBDD纯合子比AACC型纯合子母猪平均每胎多产仔1.5头(P<0.01)。研究结果表明,FSHβ亚基基因和GDF9基因与控制猪产仔数的主效基因密切相关,这可能会作为猪产仔数性状的遗传标记,而其优势基因型BBDD可以进一步改良猪的产仔数性状。

江苏地方山羊品种GDF9基因第二外显子SSCP分析

采用PCR-SSCP方法,检测了长江三角洲白山羊、黄淮山羊及波尔山羊等3个繁殖力不同品种的187只个体GDF9基因第二外显子的遗传多态性。结果表明,3个山羊品种群体GDF9基因第二外显子在引物3和引物4扩增片段中均发现多态性。引物3扩增片段中,3个山羊品种都出现AA、AB和BB 3种基因型,长江三角洲白山羊还出现了AC基因型。测序结果表明,引物3的扩增片段中,与AA基因型相比,BB基因型在第二外显子的562 bp处发生了A→C的单碱基突变,导致谷氨酰胺→脯氨酸的改变;AC基因型在第二外显子的421 bp处发生了C→T的单碱基突变,导致丙氨酸→缬氨酸的改变。引物4扩增片段中,3个山羊品种都出现DD和DE两种基因型,黄淮山羊还出现EE基因型,长江三角洲白山羊及波尔山羊还出现DF基因型。测序结果表明,与DD基因型相比,DE基因型在第二外显子的792 bp处发生了G→A的单碱基突变,导致缬氨酸→异亮氨酸的改变;DF基因型在第二外显子的791 bp、792 bp处均发生了G→A的单碱基突变,其中791 bp处的突变是沉默突变。

7种绵羊和4种山羊GDF9基因G1突变检测

前人研究表明生长分化因子9(GDF9)基因G1突变对部分绵羊品种的繁殖力有显著影响。文章采用PCR-RFLP方法在不同繁殖力的7个绵羊品种(小尾寒羊、湖羊、洼地绵羊、陶赛特羊、特克塞尔羊、杜泊羊、德国肉用美利奴羊)和4个山羊品种(济宁青山羊、贵州白山羊、辽宁绒山羊、内蒙古绒山羊)中检测GDF9基因G1突变,探究该突变与绵羊和山羊高繁殖力的关联性。结果显示:内蒙古绒山羊没有G1突变,只检测到AA基因型;其余10个绵羊和山羊品种都有G1突变,均检测到AA和AB两种基因型。

宁夏滩羊·小尾寒羊及滩寒杂交群体BMP15基因和GDF9基因多态性研究

[目的]研究宁夏滩羊、小尾寒羊及杂交群体的骨形态发生蛋白15(BMP15)和生长分化因子9(GDF9)基因多态性,为宁夏滩羊的保种及育种工作提供科学依据。[方法]以宁夏滩羊、小尾寒羊及滩寒杂交群体为研究对象,分别设计2对引物,采用PCR-RFLP方法和PCR-SSCP检测方法,检测BMP15基因和GDF9基因在宁夏滩羊、小尾寒羊及滩寒杂交群体中的多态性。[结果]BMP15基因的2对引物扩增结果的RFLP分析表明,不存在多态性位点;GDF9基因的2对引物扩增片段的SSCP分析结果表明,只有引物1扩增片段存在多态性位点,但未发现碱基序列发生改变。[结论]GDF9基因可能是控制小尾寒羊多胎性能的1个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。

BMP15和GDF9基因作为策勒黑羊和多浪羊的多胎主效候选基因的研究

本研究以BMP15基因和GDF9基因为候选基因,在策勒黑羊和多浪羊上检测BMP15基因四个突变位点:FecXG、FecXB、FecXI、FecXH以及GDF9基因突变位点FecGH,同时也对湖羊、小尾寒羊及新疆细毛羊(单胎品系)进行了检测,结果表明:策勒黑羊,多浪羊上都没有BMP15基因和GDF9基因突变,策勒黑羊和多浪羊的多胎机制与BMP15基因和GDF9基因无关。

生长分化因子GDF9基因的研究进展

生长分化因子GDF9属于生长分化因子-β超家族,它与其他成员有着很大的区别。它仅在卵巢或卵母细胞中表达,对卵泡生长发育和生殖功能等有着重要影响。笔者综述了GDF9基因的研究现状。

安徽白山羊GDF9基因群体遗传效应分析

为验证GDF9基因是否与山羊产羔数存在关联性,采集具有1-5胎产羔记录的安徽白山羊经产母羊血样265份,提取血液总DNA;根据基因序列（Gen Bank：EF446168.2）和参考文献设计4对引物,利用PCR-SSCP方法检测GDF9基因2个外显子在安徽白山羊品种中是否存在遗传多态性,采用最小二乘均值法分析遗传突变位点不同基因型产羔数之间的差异。结果表明：在外显子1中存在1个SNP EF446168.2：c.1956A〉C（同义突变）,而在外显子2中存在2个SNPs（EF446168.2：c.3319G〉A,错义突变;EF446168.2：c.4085G〉A,同义突变）。群体遗传分析发现,3个SNP位点均存在3种基因型,优势基因型频率分别为AA（0.607 5）、GG（0.750 9）、GG（0.786 8）。关联性分析表明,在EF446168.2：c.1956A〉C位点,3种基因型安徽白山羊产羔数LSM（最小二乘均值）无显著差异;对EF446168.2：c.3319G〉A位点,AA型产羔数LSM分别比GG型个体和GA型个体LSM高0.77只和0.41只（P〈0.01）;对EF446168.2：c.4085G〉A,AA型个体产羔数LSM分别比GG型个体和GA型个体LSM高0.43只和0.28只（P〈0.01）。因此,GDF9基因与安徽白山羊产羔数密切相关,可能是影响产羔数的一个主效基因;EF446168.2：c.1956A〉C、EF446168.2：c.3319G〉A、EF446168.2：c.4085G〉A可能作为分子标记,应用于安徽白山羊多胎性育种。

黔北麻羊GDF9基因多态性与产羔性能关系的研究

为了研究黔北麻羊GDF9基因多态性与产羔性能的关系,试验采用直接测序的方法对黔北麻羊的生长分化因子9(GDF9)基因外显子2核苷酸多态性及其与产羔数的关系进行了分析。结果表明:在黔北麻羊群体GDF9基因外显子2的959 bp处存在A→C的碱基突变,导致所编码的氨基酸由谷氨酰氨(Gln)突变为脯氨酸(Pro)。通过最小二乘法分析SNPs及其与产羔数的关联,结果表明:该突变对黔北麻羊平均产羔数有极显著影响(P<0.01),平均产羔数在所检测到的2种基因型中呈现出AC>AA,AC基因型比AA基因型平均产羔数多0.85只,突变杂合子个体产羔数极显著增加(P<0.01)。

宗地花猪GDF9基因多态性与繁殖性状关联性分析

为验证GDF9基因SNP位点与宗地花猪繁殖性状的关联性,从而为提高宗地花猪繁殖性能提供有价值的分子辅助标记,推进选育进程进行试验。以贵州宗地花猪经产母猪为试验素材,利用DNA池和DNA直接测序方法检测GDF9基因的多态性,对各突变位点不同基因型个体与总产仔数、产活仔数、仔猪平均初生质量和母猪泌乳力性状进行关联性分析。在受试群体中,发现基因GDF9有2个突变位点,C1009T和T1014C均位于exon2;且都与经产母猪总产仔数、产活仔数差异显著(P<0.05);基因型分别为BB>AB>AA、DD>CD>CC,母猪泌乳力基因型个体之间差异不显著(P>0.05)。仔猪平均初生质量的基因型表现为BB>AB>AA、DD>CD>CC,差异显著(P<0.05);母猪总产仔数DD基因型多于DC与CC基因型,DD基因型为优势基因型,D为优势等位基因;BB基因型在总产仔数、产活仔数的繁殖性状中多于基因型AB、AA,BB为优势基因型,B为优势等位基因。因此,研究结果表明推测等位基因D和等位基因B可能为宗地花猪总产仔数、产活仔数的有利等位基因,且DD基因型和BB基因型为有利基因型。

黔东南小香羊GDF9基因遗传变异分析

采用直接测序法检测GDF9基因在黔东南小香羊群体中的单核苷酸多态性。结果表明:在GDF9基因外显子2的550位碱基处发生了突变(A→C)并导致组氨酸突变为脯氨酸;试验检测到AA型、Aa型和aa型3种基因型;A等位基因频率为0.666 7,a等位基因频率为0.333 4。

6个绵羊群体BMP15、GDF9基因多态性分析

本研究旨在检测新吉细毛羊、中国美利奴羊(无角型)、东北细毛羊、杜×寒杂交羊(F1)、杜×寒杂交羊(F3)、白头杜泊羊6个绵羊群体骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)、生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因的多态性,为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据。以6个绵羊群体共378只个体为研究对象,利用PCR-SSCP技术检测BMP15、GDF9基因多态性;用DNAStar软件与I-TASSER软件预测蛋白质二级结构和三级结构;计算基因频率、基因型频率、Hardy-Weinberg平衡、杂合度(He)、纯合度(Ho)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)。运用GraphPad Prism 6软件对新吉细毛羊群体BMP15基因多态性与产羔数进行相关性分析。结果显示,BMP15基因P1引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型:AA、AC、CC,该突变为BMP15基因外显子1上58-60bp 3个碱基(CTT)缺失,新吉细毛羊、杜×寒杂交羊(F3)、白头杜泊羊的χ~2值均达到显著水平,处于Hardy-Weinberg不平衡状态,不同基因型间新吉细毛羊平均产羔数差异均不显著(P>0.05);GDF9基因P2引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型:DD、DE、EE,其中新吉细毛羊仅有1种基因型:DD,该突变为GDF9基因外显子2上477bp处T→C的转换,该突变未导致氨基酸的改变,除新吉细毛羊外其余5个群体χ~2值均未达到显著水平,处于Hardy-Weinberg平衡状态,说明GDF9基因T477C突变不能作为新吉细毛羊多胎性状遗传标记位点。

贵州白山羊GDF9基因编码区1007位点的多态性

生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因是卵母细胞分泌的生长因子,调节卵泡的早期生长和分化。对贵州白山羊GDF9基因的研究结果显示,编码区1007位碱基与已知山羊不同。为了研究1007位点对贵州白山羊繁殖力的影响,采用锚定PCR对GDF9基因外显子2第18位氨基酸密码子所在区域进行了扩增、克隆测序和基因型分析,结果表明,GDF9基因编码区1007位点表现出C/T多态性,使成熟肽第18位氨基酸为丙氨酸/缬氨酸替换;低产母羊均为杂合基因型,高产母羊中90%为杂合基因型,高产羊群与低产羊群之间基因型频率差异不显著(P>0.05),表明GDF9基因1007位点的多态性与贵州白山羊产羔数之间没有直接的相关性。