多重基因遗传表达分析系统及其应用研究进展

核酸检测技术广泛用于生命科学、微生物学及医学领域。随着分子生物学的发展,在经典技术的基础上研究人员又开发出多种新型检测技术。其中多重基因遗传表达分析系统(gene expression profiler genetic analysis system,Ge XP)技术作为聚合酶链式反应和芯片的换代技术,具有特异性好、灵敏度高的特点,能够同时检测多个目的基因,真正意义上实现了高通量检测。本文详细介绍了Ge XP技术的原理以及优缺点,并对Ge XP技术在畜牧兽医研究、转基因食品检测、微生物检测及医学研究中的应用进行阐述,以期为该技术将来在食品检测方面的推广提供参考。

多重基因分析系统检测幽门螺杆菌的初步研究

目的评估一种全新的幽门螺杆菌(HP)检测方法,即利用多重基因分析系统(GeXP系统)检测HP感染。方法分别用培养法、快速尿素酶法、普通聚合酶链反应(PCR)和多重基因检测法检测胃活检组织标本中的HP,用Stata 12.0统计软件评估各种方法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值,从检测方法角度横向评估多重基因法检测HP的有效性;选取16S rRNA、ureA、ureC、26KDa、cagA基因作为HP的诊断基因并做多重基因检测,从多重基因检测角度纵向评估GeXP系统检测HP感染的有效性。结果培养法的敏感性为76.8%,特异性为100.0%,阳性预测值为100.0%,阴性预测值为57.7%;快速尿素酶法的敏感性为87.8%,特异性为80.8%,阳性预测值为93.5%,阴性预测值为67.7%;普通PCR的敏感性和特异性最高,均为100.0%。GeXP系统敏感性和特异性分别为100.0%和71.3%,阳性预测值为90.9%,阴性预测值为100.0%。结论初步建立的诊断HP感染的多重基因检测法(GeXP系统)具有高敏感性、高特异性以及高通量的特点,不仅可以满足临床标本检测的需求,还可以进行根除治疗后的预后监测,具有很高的临床应用价值。

GenomeLab-(TM) GeXP检测rhIL-24联合顺铂对肺癌细胞凋亡相关基因表达的影响

目的探讨重组人白细胞介素24(rhIL-24)联合顺铂(DDP)诱导人肺腺癌A549细胞凋亡相关基因的变化。方法用160 ng/m L rhIL-24、3μg/m L DDP及160 ng/m L rhIL-24联合3μg/m L DDP处理A549细胞,应用Genome LabTMGe XP多基因遗传表达分析系统检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2、存活蛋白(survivin)、caspase-3、视网膜母细胞瘤基因(Rb)、p53的mRNA表达水平。结果 rhIL-24蛋白处理的A549细胞上调Bax、caspase-3、Rb的mRNA水平,下调Bcl-2、survivin的mRNA水平,但p53mRNA变化无规律,rhIL-24联合DDP组对A549细胞上述基因表达的影响更明显。结论 rhIL-24蛋白可通过上调Bax、抑癌基因Rb,下调Bcl-2、survivin,激活caspase-3而诱导人肺腺癌A549细胞凋亡。

Bio-Plex悬浮芯片系统检测两种实验兔白介素基因的差异表达

目的采用液相悬浮芯片系统同时测定实验兔圆小囊中IL-1β、IL-1R1、IL-8、IL-8RA和IL-15各基因的表达情况,并对该方法进行评价。方法利用Affymetrix的Panomics QuantiGene Plex 2.0 Assay中bDNA信号放大和多磁珠分析技术,来同时检测两种实验兔圆小囊中多重mRNA并定量。建立实验兔免疫相关白介素基因的液相悬浮芯片检测方法。结果可同时检测IL-1β、IL-1R1、IL-8、IL-8RA和IL-15各基因的含量,并发现WHBE兔IL-15基因的相对表达量显著高于JW兔(P<0.05),IL-1R1基因的相对表达量显著高于JW兔(P<0.01),IL-8RA基因在WHBE兔中的相对表达量也高于JW兔(P<0.05)。结论建立了实验兔白介素基因的液相悬浮芯片检测方法,WHBE兔的IL-15、IL-1R1和IL-8RA基因表达量较高,可能与WHBE兔独特的免疫学特性有关。

应用多重GeXP-PCR同时检测6种鸡免疫抑制病病毒的研究

拟建立一种基于GeXP多基因表达分析系统的多重PCR方法,同时检测6种鸡免疫抑制病病毒——鸡马立克病毒、禽白血病病毒(包括A、B和J亚群)、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊炎病毒。多重PCR反应使用嵌合引物和通用引物组合的反应体系,经过GeXP多基因表达分析系统进行毛细管电泳,鉴别PCR产物片段;通过调整嵌合引物浓度、Mg^(2+)浓度、Taq酶浓度优化反应体系及调整退火温度和时间优化反应条件。应用建立的多重GeXP-PCR,分别单独和同时检测6种鸡免疫抑制病病毒的8个目的基因,同时以其他常见禽类病毒和鸡组织器官核酸为对照,验证其特异性;检测8个目的基因不同浓度的克隆质粒,验证其敏感性;应用建立的多重PCR检测300份临床样品,并同时用荧光定量PCR和测序验证其检测结果的准确性。结果表明建立的多重GeXP-PCR方法能够分别扩增出6种病毒,8个特异性目的片段,不能扩增其他常见禽类病毒和鸡组织器官的基因;在低至100copies·20μL^(-1)的水平能同时特异性地检测出6种鸡免疫抑制病病毒核酸;检测300份临床病死鸡样品,190份样品显示为阳性,PCR和测序结果与多重GeXP-PCR结果相符。本研究建立的多重GeXP-PCR方法可特异、敏感、高通量地检测6种鸡免疫抑制性病毒,可用于临床鉴别诊断和分子流行病学调查,具有很高的临床应用价值。

GeXP多重基因表达分析系统研究进展

Genome Lab Ge XP(Gene e Xpression Profiler)是由美国Beckman Coulter公司推出一个多基因分析平台。该系统采用荧光标记的通用引物和末端连接有通用引物序列的特异性嵌合引物相结合引发多重体系扩增,解决了由于PCR选择和PCR漂移引起的传统多重PCR技术的扩增偏爱性,并与毛细管电泳相结合,解决了琼脂糖凝胶电泳因分辨率不高造成的假阴性和假阳性。本文主要介绍了Ge XP多重基因表达分析系统的技术背景、基本原理、扩增优势,重点阐述了其在各方面的应用现状及发展趋势。

GeXP多重基因表达分析系统及其应用

介绍了GeXP多重基因表达分析系统图的基本原理,重点阐述了该系统在多重基因表达分析和病毒检测方面的应用,并对该系统在病毒检测方面的应用前景进行了展望。

GeXP多重基因表达遗传分析系统应用于人乳头瘤病毒的分型检测

本文建立了一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的单管多重PCR方法，用于人乳头瘤病毒（HPV）的分型检测。以11种HPV亚型为研究对象，其中包括9种高危亚型（HPV16，18，31，33，35，39，52，58，66）和2种低危亚型（HPV6和11）。体系中的引物包括11对亚型特异性的嵌合引物和一对通用引物，保证了各个目的片段具有相对一致的扩增效率。该方法特异性好，

多重基因表达遗传分析系统在转基因食品检测中的应用

目前，国内外对转皋凶食品检测技术种类较多，常用的PCR大多是针对单个基因的，费时且成本较高。

多重基因表达分析系统在氨基糖苷类多重耐药基因检测中的应用

氨基糖苷类抗生素耐药趋势逐年增强，氨基糖苷类耐药基因的研究成为近年来研究的热点问题。与细菌耐药最为密切的是氨基糖苷类修饰酶（aminoglycoside modifying enzymes，AMEs）基因和16S rRNA甲基化酶（16S rRNA methylase）基因，国内最常见的氨基糖苷类抗生素相关的耐药基因有：5种AMEs基因aac（3）-Ⅱ、aac（6’）-Ⅰb、aac（6’）-Ⅱ、ant（3＂）-Ⅰ、

一种新型多重PCR技术在肿瘤研究中的应用

多重基因表达遗传分析系统(GenomeLab gene expression profiler genetic analysis system,GeXP)是一种全新的基因表达谱定量分析平台。它能够在同一反应中对多至35个基因进行定量检测和分析,并将通用引物与特异引物相结合。它采用荧光毛细电泳分离技术对多重PCR产物进行定量检测和分析。本文重点综述了多重基因表达遗传分析系统的技术原理及其在肿瘤研究中的应用。

应用GeXP系统检测败血症患者肺炎克雷伯杆菌多重耐药基因的研究

目的采用GeXP系统检测肺炎克雷伯杆菌多重耐药基因,以指导败血症患者的临床治疗。方法从败血症患者血液标本中分离出肺炎克雷伯杆菌,用建立GeXP多重耐药基因检测体系,对其多重耐药基因进行检测。结果扩增出的7对特异性目的基因片段的大小与设计的引物相符合,拼接后比对与基因库中公布的相应基因序列吻合。以该引物多重PCR扩增肺炎克雷伯多重耐药基因,扩增产物用GeXP毛细管电泳分离,根据扩增的基因片段大小确定各峰分别为rmtB（176.71/179.03bp）、aac（6’）-Ib（190.74/192.56bp）、aac（6’）-Ⅱ（218.67bp）、armA（249.84bp）、aac（3）-Ⅱ（268.63/270.51bp）、aph（3’）-IV（289.18bp）、ant（3’）-Ⅰ（319.24/320.99bp）,片段长度与理论值误差为3～5bp,即在GeXP毛细管电泳分离过程中发生了片段大小漂移现象。结论采用GeXP系统能从败血症患者感染的肺炎克雷伯杆菌检测出7个不同大小的耐药基因,可据此指导败血症的临床治疗。

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物,在每对特异性引物的5＇端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10^3,10^2,10^1拷贝/μl,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10^4,10^3,10^2,10^1拷贝/μl,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10-1拷贝/μl;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10^3拷贝/μl水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。

猕猴桃多重高效基因组编辑系统研究

中科院华南植物园黄宏文研究员等人,建立了一种新的快速高效的成对sgRNA的Cas9双元表达载体的构建策略,研究论文发表于Plant Biotechnology Journal.猕猴桃为我国特有的雌雄异株多年生果树,因其丰富的营养价值和独特的风味而成为全球性重要的新兴水果.猕猴桃中PTG/Cas9系统的靶标突变效率相比传统的CRISPR/Cas9系统高出近10倍.

一种获取巴斯德毕赤酵母高拷贝重组子的新方法

目的 :探讨一种简化的高效获取用于表达重组蛋白的巴斯德毕赤酵母高拷贝重组子的新方法 ,即多重转化筛选法。方法 :按经典方法转化宿主菌和利用G4 18多拷贝筛选法从转化子中筛选出含目的基因表达盒拷贝数最高的菌株 ,然后以之作为新一轮的转化宿主菌。如此重复进行数轮上述转化筛选过程 ,直到获得含有尽可能多拷贝目的基因表达盒的重组子 ;同时将此方法 ,即多重转化筛选法与经典方法进行比较。结果 :与经典方法相比 ,多重转化筛选法通过筛选较少量转化子即可轻而易举地获得较多的高拷贝重组子 ,工作量更小 ,效率更高。结论 :多重转化筛选法是一种更高效地获取毕赤酵母高拷贝重组子的新方法。

GeXP多重PCR法同时检测5种致泻性大肠埃希菌

目的基于GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立快速、同时检测5种致泻性大肠埃希菌的方法。方法根据肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠集聚性大肠埃希菌(EAEC)和肠出血性大肠埃希菌(EHEC)的12种毒力基因的保守序列设计特异性引物,用单组引物分别进行PCR扩增,验证单模板单引物PCR的特异性。分别以5种致泻性大肠埃希菌基因组DNA为模板,每个体系中混合12种引物进行PCR扩增,验证单模板多重PCR的特异性。采用GeXP多重PCR分别扩增10~6、10~5、10~4、10~3CFU/mL的5种致泻性大肠埃希菌混合菌悬液DNA模板,分析该方法的灵敏度。用购自超市和农贸市场的食品制作34份加标样品,采用GeXP多重PCR鉴定5种致泻性大肠埃希菌,并与多重实时荧光PCR检测试剂盒检测结果比较。结果单模板单引物PCR产物中,12种毒力基因sth、pic、bfpB、astA、lt、escV、aggR、stx1、uidA、invE、stx2、stp扩增片段大小与设计相符,荧光信号值良好,均在25000 A.U.以上。GeXP单模板多重PCR体系中,5种致泻性大肠埃希菌的12种毒力基因PCR产物片段大小与设计相符,特异性良好。菌液浓度为10~3CFU/mL时,GeXP多重PCR可同时检测出12种毒力基因,荧光信号强度良好,重复检测结果相同,变异系数<10%。采用GeXP多重PCR检测34份加标样品,检出ETEC 3株,EAEC 12株,EIEC、EPEC和EHEC各1株,与商品化的5种致泻性大肠埃希菌多重实时荧光PCR检测结果一致。结论本研究建立了一种同时检测5种致泻性大肠埃希菌12种毒力基因的GeXP多重PCR方法,可用于致泻性大肠埃希菌的临床鉴别诊断及流行病学调查研究。

细菌外排泵介导耐药性研究进展

随着抗生素的广泛应用,临床上产生一些多重耐药菌株。多重耐药菌株的产生使常规抗生素在临床细菌性感染治疗中失效。细菌主动外排是耐药菌株产生多重耐药的主要机制之一;因此有关细菌主动外排泵的研究也是近年来细菌多重耐药机制研究中,相对较新和活跃的领域。本文结合当前主动外排泵研究的进展,对主动外排蛋白的分类、组成和主要的主动外排系统的基因表达调控以及耐药性情况进行综述。

卫生统计

完全随机设计两样本率比较的非条件确切检验方法；差异表达基因鉴别的SAM和RVM的比较；缺失数据的多重估算；对应分析在探索交叉数据表行、列变量关系时的应用；有缺失数据的2×2交叉设计的多重填补与分析；比例优势模型实现ROC分析的方法及其应用前景分析；关于数理统计中系统聚类法的讨论．